Cuantificación por Espectrofotometría

 Facultad de salud
Enfermería



















TEMA: Cuantificación por Espectrofotometría




Índice

Portada……………………………………………………………………………………1
Índice………………………………………………………………………………………2
Introducción……………………………………………………………………………….3
Objetivos……………………………………………………………………………………4Materiales…………………………………………………………………………………..5
Método experimental…………………………………..………………………………6-7
Cálculos…………………………………………………………………………………...8
Resultados……………………………………………………………………...………..9
Discusión………………………………………………………...……………………10-11
Conclusión…………………………………………………………..……………………12
Bibliografía………………………………………………………………………….…….13









Introducción
Antiguamente el proceso de análisis químico era muydifícil de llevar a cabo , ya que se tardaba semanas en saber los resultados del proceso y aun así no se sabía con certeza si estos eran 100% fiables; con el tiempo los estudiados en el tema le nació la necesidad de simplificar estos procesos e investigando llegaron a inventar el espectrofotómetro este se convirtió hoy en día el procedimientos analítico más utilizado en la bioquímica, siendo unode los métodos más útiles en el análisis cuantitativo de diversas moléculas y con un proceso que no se demora más que minutos.
El principio básico de este método cuantitativo se basa en la capacidad de las sustancias para absorber luz, en una longitud de onda determinada, en proporción a la cantidad de materia presente.
Mediante el espectrofotómetro, que es un instrumento del cual se obtieneuna medida del valor de la absorbancia la cual es la longitud de onda que la muestra absorbe, la cual es utilizada para detectar, identificar moléculas y medir su concentración en solución. Esta medición se basa en la Ley de Beer y Lambert la cual establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida por dicha sustancia.
En elsiguiente informe se mostraran los resultados de la absorbancia que se obtuvieron a través del espectrómetro para luego dar paso a la determinación de las concentraciones de proteínas y fabricar un grafico de la absorbancia versus la concentración.





Objetivos
Cuantificar proteínas con el método de espectrofotometría.
Realizar curva de calibración con los resultados obtenidos según concentración yabsorbancia
Comprobar la ley de Lambert Beer según la ecuación de la recta obtenida
Determinar la concentración de proteínas de una muestra problema.
Medir la absorbancia de diferentes muestras con variada concentración de proteínas















Materiales
Reactivos
Estándar de BSA (albúmina de suero de bovino) 100 mg/mL
Reactivo de Biurett

Muestras Biológicas:
Extracto proteínico (muestra deleche descremada industrial)

Materiales/equipos
Tubos de ensayo
Micro Pipetas de 20 µL – 200 µL
Micro pipetas de 100 µL– 1000 µL
Vortex
Gradilla para tubo de ensayos
Espectrofotómetro/cubetas









Método experimental:

A) En un comienzo para construir la curva de calibración se debieron preparar diluciones de proteínas estándar (BSA) a partir de una solución de stock 0,5 µg / µl.

1. a) Seprocedió a enumerar 5 tubos de ensayo.
b) Fueron agregadas las concentraciones de agua y albumina que se señalan en la siguiente tabla.

Tubo
Albumina (µl)
Agua (µ)
µg prot. totales
Absorbancia
1
200
700
100
0,213
2
100
800
50
0,110
3
40
860
20
0,076
4
20
880
10
0,002
5
0
900
0
Usar como muestra blanco

2. A cada solución se le agregó unos 100 µl de solución de Biurett
3. Mesclar biendejando pasar 5 minutos para que adquiera el color
4. Se midió la D. O. a 595 µl, a partir de la más diluida a la mas concentrada para así utilizar la misma cubeta para todas las mediciones


5. Graficar absorbancia versus la concentración estándar
B) Calculo de la concentración de proteínas de la muestra

1. Se preparó la muestra utilizando 100µl de muestra y combinado con 800 µl de agua...