cultivo de tejidos

Optativa de biotecnología 1.
Cultivo de tejidos en la agricultura.
Cultivo de tejidos es aislar una parte de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas.
Mantener asepsia, para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana.
Organización de laboratorio
1. Área de preparación.
Espacio para preparar, almacenar material yreactivos, balanza, medidor de pH, platos calientes con agitación, incubadora, refrigeración.
2. Área de lavado y de esterilización.
Lavadero con agua caliente y fría, fuente de agua con alto grado de pureza (doblemente destilada), basureros.
Autoclave, estufas, secadores, lavadero con agua caliente y fría.
3. Área de transferencia.
Actividades de escisión, inoculación y transferencia de losexplantes a medios de cultivo. Gabinetes de flujo horizontal y vertical , lejos de corrientes de aire o puertas.
4. Área de incubación.
Gabinetes y cámaras de crecimiento. T de 20-28 °C, iluminación de 1000-5000 lux, humedad relativa de 70-80%. Estanterías.
5. Área de observación y examen.
Microscopios.
6. Área de crecimiento.
Acondicionamiento de plantas para trasplantarlas en macetas.
7.Áreas de cuarentena y control fitosanitario.
Recepción de muestras o área de plantas destinadas a limpieza clonal.
8. Área de oficina.
Equipo de laboratorio
Control preventivo de contaminación microbiana
Tejidos. Tienen contaminantes en la superficie o en el interior. El primero se resuelve con desinfección. En el segundo se pueden usar fungistáticos o bacteriostáticos en el medio de cultivo:sulfato de gentamicina, penicilina, sulfato de estreptomicina (10-50 mg/L), productos de amplio espectro. O tratamiento de calor a 35-40 °C.
Trabajar en áreas con sistema de flujo de aire con filtros, paredes y mesas desinfectadas. Usar instrumentos esterilizados, usar alcohol y flamearlos por 2-3 minutos. Flamear la boca de los tubos de ensaye antes y después de abrirlos.
EsterilizaciónEsterilización: proceso de eliminación de MO vivo o espora.
En medicina, asepsia es ausencia de MO patógenos.
En cultivo de tejidos: asepsia=estéril.
Desinfección: destrucción de MO por métodos químicos, esterilización es por métodos físicos.
Axénico: preparaciones libres de virus, viroides o microplasmas.
Preparación de explante
Se considera que las partes de las plantas intactas y sanas sonasépticas internamente.
Esterilización superficial:
Hipoclorito de sodio (NaOCl), C de 1-3%, germicida y agente oxidante.
Por su alcalinidad, puede enjuagarse rápidamente con sol. HCl.
Bicloruro de mercurio (HgCl2), esterilizante. Es tóxico. C de 0.1-1.5% p/v, exposición de 3-5 minutos. Complicado de remover.
Procedimiento de esterilización
Calor húmedo (vapor abierto o vapor a presión)o seco.Calor seco: para recipientes de vidrio secos.
A 170°C, por 2 horas, no menos de 1.
Para algodón y papel, T menor a 170°C por aprox. 1 hora o más.
Vapor bajo presión (autoclave): medios de cultivo, para componentes no termolábiles.
Destruye toda forma de bacterias, hongos y sus esporas. Extraer aire, para que suba la T. 15 lb durante 20 minutos, a 121 °C. Ninguna sustancia es estéril siqued en ella un organismo viable o espora.
Presión (lb)
Temperatura (°C)
Tiempo (minutos)
10
115.5
30
15
121.5
20
20
126.5
15

Calor húmedo a 100 °C.
Por 15 minutos, para matar todas las formas vegetativas microbianas, pero no todas las esporas. Se recomienda la esterilización intermitente, con periodos de exposición de 30-60 minutos diarios por 3 días. En la 1, mueren las formasmicrobianas, a las 24 horas germinan las esporas y mueren en la segunda exposición, la 3 es por prevención. De 60-80 °C durante 4-7 días. Se llama también método de Koch. Puede reemplazarse por un método de filtración.

Filtración.
Mediante filtros de hongos y bacterias, los filtros deben esterilizarse antes. La capacidad de retención de MO depende del tamaño de poro, pH, carga eléctrica...