Curva estándar de proteína

INTRODUCCIÓN
Las técnicas para determinar la concentración de proteínas son procedimientos rutinarios cuando se requiere la purificación de una proteína concreta y conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros propósitos.
Hay diversos métodos para la cuantificación de las proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos o c) la capacidad que tienen las proteínas de unirse a ciertos colorantes.
Una curva de calibración representa la respuesta de un método analítico a concentraciones conocidas de analito. Un instrumento llamado espectrofotómetro mide la absorbancia de la luz, que es proporcional a lacantidad de proteína analizada. Las disoluciones que contienen concentraciones conocidas de analito se llaman disoluciones patrón o estándar.
Se han desarrollado diversos métodos para determinar la concentración de una proteína en solución. Una de las más comunes es el de Lowry.
El método de Lowry se basa en el color azul que dan las proteínas con el reactivo de Fenol-Folin-Ciocalteu. Eneste método se desarrollan dos reacciones coloridas: primero se desarrolla un color de poca intensidad con el cobre (Cu2+), en medio alcalino; después se forma un color azul con el reactivo mencionado, que contiene tungsteno de sodio y molibdato de sodio en presencia de ácido fosfórico y clorhídrico, que reacciona con el grupo fenólico de los aminoácidos aromáticos, fenilalanina y triptófano dela proteína. Este método permite determinar la concentración de proteína en rangos de 0.01-1 mg/ml. La absorbancia a 750 nm es proporcional a la concentración, para proteínas análogas, construyéndose, con ellas, una curva patrón.

HIPÓTESIS
La curva de calibración mostrara una respuesta lineal y la concentración problema caerá dentro del intervalo de dicha curva. A mayor microlitros demuestra problema agregada, se observará mayor absorbancia.

OBJETIVO

* Determinar la concentración de proteínas en una muestra problema a partir de concentraciones conocidas de la proteína albúmina de suero bovino (BSA).


RESULTADOS
Mediante el desarrollo experimental se obtuvieron los siguientes resultados prácticos para cada método:

I) Determinación de proteína de albúminade suero de bovino (BSA) por absorbencia a 280nm

Tabla 1. Volúmenes y cantidades del estándar de BSA para determinar la concentración de proteínas de una muestra utilizando la absorbancia a 280nm.
Tubo | H2O (μL) | BSA (1mg/mL) | Muestra problema | A280nm | Proteína (μg) |
0 | 500 | - | - | 0.000 | 0 |
1 | 485 | 15μL | - | 0.136 | 15 |
2 | 470 | 30μL | - | 0.170 | 30 |
3 | 455 |45μL | - | 0.203 | 45 |
4 | 440 | 60μL | - | 0.215 | 60 |
5 | 425 | 75μL | - | 0.225 | 75 |
6 | 410 | 90μL | - | 0.280 | 90 |
7 | 395 | 105μL | - | 0.303 | 105 |
8 | 475 | - | 25μL | 0.130 | - |
9 | 450 | - | 50μL | 0.148 | - |





Gráfico 1. Curva de estándar de proteína BSA para la determinación de la cantidad de proteína en una muestra problema por el método deAbsorbancia a 280nm.




Muestra problema (μL) | A750 nm | Proteína (μg/uL) |
25μL | 0.13 | 18 |
50μL | 0.148 | 36 |
Tabla 2. Determinación de la cantidad de proteína contenida en la muestra problema

II) Determinación de proteínas por el método de Lowry

Tabla 3. Reactivos y cantidades que se utilizaron para realizar la curva patrón de BSA y la determinación de la concentraciónde proteína en una muestra problema por el método de Lowry.
Tubo | H2O (μL) | BSA (1mg/mL) | Muestra problema | Reactivo A (μL) | Reactivo B (μL) | A750nm | Proteína (μg) |
1 | 450 | - | - | 500 | 250 | 0.000 | - |
2 | 445 | 5μL | - | 500 | 250 | 0.184 | 5 |
3 | 440 | 10μL | - | 500 | 250 | 0.244 | 10 |
4 | 435 | 15μL | - | 500 | 250 | 0.338 |...