Determinación de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina

Determinación de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina

Objetivos

-Determinación de la actividad enzimática.
-Determinación de los parámetros cinéticos de la enzima.

Introducción

Una de las características más importantes de las enzimas es su especificidad, la cual se puede definir mediante parámetros cinéticos asociados a la velocidad de reacción de unaenzima con un sustrato.
La actividad enzimática, o la velocidad con que una enzima cataliza la formación de un producto, directamente relacionada tanto con la cantidad de enzima que es utilizada en el tiempo, o lo que es lo mismo la cantidad de sustrato que se va formando. Es por esto que las mediciones de tiempo deben ser muy prolijas, ya que las relaciones a deducir a partir de laexperiencia son muy dependientes del tiempo.
Conociendo la velocidad de reacción y las concentraciones de sustrato en el tiempo es posible elaborar la representación de Lineweaver-Burk, que relaciona en una ecuación lineal las cantidades inversas de los parámetros antes mencionados.

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Figure 1: Representación de Lineweaver-Burk

Como se muestra en la figura 1, a través de estarepresentación es posible obtener la velocidad máxima de reacción (Vmax) y la constante de Michaelis (km).
Durante esta experiencia trabajaremos con una muestra de fosfatasa alcalina, enzima que cataliza la reacción de hidrólisis de monoesteres orgánicos de fosfato, a un pH optimo entre 9-10.

Procedimiento Experimental

Se trabajaran con 3 grupos de 5 tubos de ensayo,los que se diferencian en volumen de tampón, sustrato y enzima dependiendo de qué actividad se esté realizando.
1. Efecto de del tiempo en la aparición del producto: se trabaja con los mismos volúmenes de sustancias para cada tubo de ensayo y se retiran del baño de calor a diferentes tiempos. Una vez retirados los tubos se agrega fosfato para detener la reacción y se mide la absorvancia.
2.Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción: en este caso cada tubo de ensayo posee diferente concentración de enzima y tampón, pero la misma concentración de sustrato, se llevan los tubos a baño durante 10 minutos, luego se le añaden 0,5 ml de detención y se mide la absorvancia a 450nm.
3. Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción: paraesta experiencia se mantiene constante el volumen de enzima, una vez preparados los tubos se llevan a un baño a 30°C durante 10 minutos. Finalmente se retiran, luego se agrega solución de detención y se mide la absorvancia a 495 nm.

Resultados

• Actividad 1

|Tabla 1: Progreso de Reacción |
|Tubo |Tiempo (min) |Absorvancia (405 nm) |[Producto] (mM) |
|1 |5 |0,4602 |0,024875676 |
|2 |10 |1,078 |0,05827027 |
|3 |15 |0,6207 |0,033551351 |
|4 |20 |0,6927 |0,037443243 |
|| | | |

Gráfico 1: Tiempo v/s Concentración de producto
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La ecuación de esta recta es: [pic]
De esta expresión se puede deducir que la velocidad de reacción es equivalente a la pendiente y por lo tanto es: 0,0541 μmol/min.

• Actividad 2
|Tabla 2: Velocidad de reacción frente a Volumen de Enzima Variable|
|Tubo |Enzima (ml) |Absorvancia (nm) |Producto (mM) |Velocidad (mM/min)|
|1 |0,2 |0,1113 |0,006016 |0,000602 |
|2 |0,4 |0,23205 |0,012543 |0,001254 |
|3 |0,6 |0,33975 |0,018365 |0,001836 |
|4 |0,8...