Determinación de actividad de NFAT

TransAM NFATc1 ACTIVE MOTIF

UNIÓN DE NFAT A SU SECUENCIA
1. 40 µL binding buffer AM1 a cada pocillo.
2. Muestras: 10µl/pocillo de muestra diluidas en Complete lysis buffer con 2-10 µg deextracto nuclear
Control positivo: 5µg diluido en 10 µl de CLB (2µl jurkat + 8µl CLB)
Blanco: 10µl CLB
3. Sellar e incubar 1h a RT en agitación
4. Lavar 3X con 200 µl 1X wash buffer
UNIÓN DELANTICUERPO PRIMARIO
1. 100 µL/pocillo de NFAT Ab (1:500) en Ab binding buffer
2. Sellar e incubar 1h a RT sin agitación
3. Lavar 3X con 200 µl 1X wash buffer
UNIÓN DEL ANTICUERPO SECUNDARIO
1. (Sacardeveloping solution a atemperar)
2. 100 µL/pocillo de anti-mouse HRP-conjugated ab (1:1000) en Ab binding buffer
3. Sellar e incubar 1h a RT sin agitación
4. Lavar 4X con 200 µl 1X wash bufferREACCIÓN COLORIMÉTRICA
1. 100 µL/pocillo de developing solution.
2. Incubar 5-10’ a RT protegido de la luz.
3. Añadir 100 µL/pocillo de stop solution
4. Leer absorbancia en espectrofotómetro antes de5’ a 450 nm

Reactivo
Componentes
Por pocillo
1 tira (8 pocillos)
6 tiras (48 pocillos)
12 tiras (96 pocillos)
Observaciones
Complete lysis buffer
DTT 1M
0,01 µl
0,1 µl
0,6 µl
1,2 µl
 Cocktail inh.proteasas
0,12 µl
0,9 µl
5,4 µl
10,8 µl


Lysis buffer AM1
11,12 µl
89 µl
534 µl
1,068 ml

 
TOTAL
11,25 µl
90 µl
540 µl
1,08 ml

Binding buffer AM1
TOTAL
45µl
360 µl
2,16 ml
4,32 ml
 
1X Wash buffer
10X Washing buffer AM2
225 µl
1,8 ml
10,8 ml
21,6 ml
Dura 1 semana a 4°C

Agua destilada
2,025 ml
16,2 ml
97,2 ml
194,4 ml

 
TOTAL2,25 ml
18 ml
108 ml
216 ml

1X Ab binding buffer
10X Ab binding buffer AM3
22,5 µl
180 µl
1,08 ml
2,16 ml
Para 1io y 2io

Agua destilada
202,5 µl
1,62 ml
9,72 ml
19,44 ml

 TOTAL
225 µl
1,8 ml
10,8 ml
21,6 ml

Developing solution
TOTAL
112,5 µl
900 µl
5,4 ml
10,8 ml
Sensible a la luz
Stop solution
TOTAL
112,5 µl
900 µl
5,4 ml
10,8 ml
Corrosivo...