Determinación De La Actividad Telomerasa Y Diseño De Primers Para La Caracterización Molecular De Hesc

Determinación de la Actividad Telomerasa y Diseño de Primers
Para la Caracterización Molecular de hESC.

Para la detección de actividad telomerasa en un cultivo de células madre embrionarias,el primer paso consiste en realizar una extracto celular del cultivo que se pretende analizar,
para poder obtener un extracto con el que realizar la determinación. A continuación se rea lizauna PCR para los telomeros, que se corre mediante electroforesis en un gel de acrilamida al
10%. Se hace con acrilamida en vez de agarosa porque el poro es más idóneo para que pasen
los telómeros.El gel se tiñe con SybrGreen. Además de los pocillos donde se ponen las
muestras de cultivo, se utilizan también otros pocillos para poner controles negativos con
fibroblastos (sin actividadtelomerasa) y con extracto inactivado por calor, que no deberían dar
señal telomerasa. Después de realizar la electroforesis, y teñir el gel con SybrGreen, se realiza
la foto para ver las bandas ydeterminar la actividad telomerasa.

El diseño de primers para PCR convencional o cuantitativa se realiza utilizando
programas informáticos online como Genatlas, o primer3 además del BLAST oel P ubMed. Lo
primero que se debe hacer es buscar y estudiar tu secuencia problema con bases de datos
como el Genatlas o el PubMed. Una vez eliminados los intrones (en el caso de hacer análisisde
mRNA) buscamos con el “primer3” primers con los parámetros deseados, y una vez obtenidos
se comprueba que el forward y el reverse estén situados en dos exones distintos para
asegurarnos queno amplifican otra cosa (contaminación etc). Es mejor diseñar un par de
parejas de primers para asegurarnos de que alguno de los dos funcionará y no tener que
rediseñarlos. Por último se debecomprobar que tu amplicón no tiene homología con alguna
otra secuencia, y esto se hace mediante “BLAST”. Ya solo queda pedir los primers a la casa
comercial tal cual vienen en el “primer3”.