Reglas para el diseño de primers

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL O Q-PCR
Introducción Generalmente los resultados de los experimentos de microarrays tienen que ser validados por medio de otras plataformas, y entre ellas la PCR a tiempo real es la más extendida. Por ello, la Unidad de Expresión Génica ofrece la solución íntegra desde el procesamiento del microarray hasta el servicio de validación deresultados. La PCR a tiempo real o PCR cuantitativa es una variación de la PCR estándar utilizada para la cuantificación de DNA o de RNA mensajero (mRNA) de una muestra. Utilizando primers específicos de secuencia, es posible determinar el número de copias o la cantidad relativa de una determinada secuencia de DNA o RNA. Cuando la PCR a tiempo real se combina con una reacción de retro-transcripción oRT (RTPCR), puede determinarse la cantidad de mRNA de una muestra mediante una cuantificación relativa. Dicha cuantificación se denomina relativa ya que se compara entre diferentes muestras (tejidos, tratamientos, time-points, etc) la cantidad relativa o relación del mRNA de un gen específico respecto a la cantidad de mRNA de un gen constitutivo (control endógeno). Para la cuantificación, se mideen cada ciclo de PCR la cantidad de amplicón producido. La cuantificación del producto se produce mediante la adición de fluoróforos que se unen al amplicón de forma cuantitativa, de forma que a mayor producto mayor fluorescencia se emitirá. Los sistemas de PCR a tiempo real detectan la cantidad de fluorescencia producida en cada ciclo de PCR y los softwares de análisis representan dichafluorescencia gráficamente respecto al número de ciclos. La cantidad de amplicón producido es proporcional al número de moléculas de RNA/DNA iniciales, de forma que en aquellas muestras con mayor expresión del gen el amplicón fluorescente aparecerá en ciclos anteriores.
Figura 1. Gráfica amplificación de PCR a tiempo real. El eje vertical representa la cantidad de fluorescencia normalizada, y el ejehorizontal el número de ciclos. La Baseline o línea base se refiere a los ciclos iniciales en los que no hay cambios detectables en la cantidad de fluorescencia, y sólo se detecta la fluorescencia basal. Threshold es el umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia, y el corte entre el Threshold y la curva de amplificación determina el Ct o ciclo umbral que se emplea para lacuantificación. El cálculo del Ct siempre se realiza en la fase exponencial de la curva.

Figura 2. Gráfica de amplificación por PCR a tiempo real en escala logarítmica. 5 muestras con diluciones seriadas de la cantidad inicial de cDNA.

Tipos de fluorocromos Se utilizan principalmente dos tipos de fluorocromos. Un método muy utilizado por su menor coste es el emplear fluoróforos que se unen aDNA de doble cadena, como SYBR Green. El SYBR Green se une inespecíficamente al DNA de doble cadena y produce fluorescencia. Estos fluorocromos no son específicos ya que se unen a toda molécula de DNA de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer. Otra alternativa, más cara pero recomendada cuando hay problemas de especificidad, es el uso de sondas específicas fluorescentes, como las sondasTaqMan. Esta técnica permite la cuantificacación específica del cDNA de interés incluso en la presencia de amplificación inespecífica (dímeros de primer, DNAg). El uso de SYBR Green implica un diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar dímeros de primer, y evitar la amplificación de DNA genómico contaminante en la muestra de cDNA, para ello, deben diseñarse los primers de forma queel amplicón contenga secuencias de diferentes exones. Controles endógenos La medida de la expresión génica por medio de RT-PCR es una cuantificación relativa, en la que se compara entre las diferentes muestras la expresión del gen objeto de estudio respecto a la expresión de un gen constitutivo cuya expresión no varía en las condiciones del experimento (control endógeno). Es lo que se denomina...