Diagnostico de paternidad

Los cambios en el procedimiento del protocolo respecto al propuesto están señalados en negrita.

PROTOCOLO PARA EL DIAGNÓSTICO DE PATERNIDAD

1. Materiales:

Para cada participante del grupo:

1.1. Extracción de ADN

Reactivos:
● 0,135g de sal
● Agua destilada
● 500µl de disolución de Chelex 10%
Material:
● Vaso
● Varilla de cristal
● Tubo de ensayo (15ml)● Rotulador indeleble
● Pipeta de plástico
● Hielo
● Micropipetas y puntas (10-100, 100-1000µl)
● 2 tubos eppendorf (1,5ml)
● Fórceps
● Basura
Máquinas:
● Balanza granataria
● Centrífuga clínica o de baja velocidad
● Calentador eléctrico
● Centrífuga de alta velocidad

1.2. PCR

Reactivos:
● 2 “Bolas”: mezcla de reactivos PCR(Ready-to-go PCR Beads, Amersham Pharmacia)
● 10µl de cada cebador (Alu-5’, Alu-3’, D1S80-5’, D1S80-3’)
● 50µl Aceite mineral
Material:
● 2 tubos eppendorf (0,2ml)
● Micropipetas (0,5-10,10-100µl)
Máquinas:
● Termociclador

1.3. Electroforésis

Reactivos:
● Agarosa en polvo 1,5%
● TAE 1x tampón de electroforésis
● TE tampón (Tris-EDTA)
● Bromuro deetidio (1µg/ml)
● Azul de bromofenol
● Marcadores del peso molecular
Material:
● Matraz (100ml)
● Pipetas y puntas (0,5-10, 10-100µl)
● Bandeja para la preparación del gel
● Peines para las bandejas
● Cámara electroforética horizontal (molde del gel)
● 5 Tubos eppendorf
Máquinas:
● Microondas
● Transiluminador de luz UV.

2. Procedimiento:

2.1.Procedimiento de extracción de ADN[1]:

1. Extracción de nuestro ADN mediante saliva. Para ello, haremos un enjuague intenso con una disolución de NaCl. De este modo, conseguiremos que algunas células de la cavidad bucal se desprendan. La disolución salina se preparará previamente en un vaso. Se le añadirán 15ml de agua destilada y 0,135g de sal; y posteriormente se removerá con una varillade cristal hasta que la sal quede disuelta completamente.
Es importante que las personas a las que se les realice la extracción, no fumen, ni coman o beban una hora antes de la recolección de saliva [2].

2. La disolución salina que contiene nuestras células se echará primero al vaso y después a un tubo de ensayo de 15ml (poner el nombre de cada uno con rotulador indeleble).3. Cerrar bien el tubo de ensayo y colocarlo en el rotor de la centrifuga clínica (o de baja velocidad) de forma equilibrada con los demás tubos. Para equilibrarlos utilizar una balanza granataria y agua destilada (introducir el agua destilada entre el tubo de ensayo y el tubo de la centrifuga mediante una pipeta de plástico). Centrifugar a 2.400 rpm durante 10 minutos. De esta forma,conseguiremos separar las células del resto de componentes, quedando estas en el fondo del tubo de ensayo formando el pelet.

4. Con mucho cuidado y sin remover el pelet, verter el sobrenadante en el vaso que se utilizó al principio para la disolución salina; y poner el tubo de ensayo en hielo.

5. Pipetear la disolución de Chelex arriba y abajo varias veces para resuspender bien las partículas deChelex. Antes de que se empiece a sedimentar otra vez el Chelex, trasferir 500µl al tubo de ensayo que contiene el pelet. Utilizar una micropipeta de 100-1000µl.

6. Resuspender las células en el Chelex (mismo procedimiento que el anterior) y después de comprobar que no quedan grupos de células, transferir de la suspensión de células a un tubo eppendorf. Utilizar la misma micropipeta que en elpaso 5.

7. Poner el tubo eppendorf en agua hirviendo e incubar durante 10 minutos. De éste modo conseguiremos que las células se rompan liberando así el ADN.

8. Después de la incubación, sacaremos el tubo eppendorf del agua hirbiendo (usando el fórceps) y lo enfriaremos en el hielo durante un minuto.

9. Realizar una nueva centrifugación en una centrifuga de alta velocidad a...