Effetti Del Resveratrolo Sull'Invecchiamento Cellulare In Fibroblasti Umani

Facoltà di Farmacia
Corso di Laurea Specialistica in
Biotecnologie Farmaceutiche
Dipartimento di Farmacologia



Effetti del resveratrolo sull'invecchiamento cellulare in fibroblasti umani



Relatore: Prof.ssa Lisa Giovannelli
Correlatore: Dott.ssa Vanessa Pitozzi


Tesi di laurea di:
Giovanna Sanna



Anno Accademico 2007-2008




INDICE

1.L’INVECCHIAMENTO 5
1.1 DEFINIZIONE DI INVECCHIAMENTO 5
1.2 TEORIE DELL’INVECCHIAMENTO 7
1.2.1 Teoria della regolazione genica 9
1.2.2 Teoria evoluzionistica 13
1.2.3 Teoria neuroendocrina 15
1.2.4 Teoria immunitaria 17
1.2.5 Teoria dei radicali liberi (RL) 18
1.2.5.1 I radicali liberi 181.2.5.2 Principali fonti endogene di ROS 19
1.2.5.3 Funzioni esercitate dai ROS 20
1.2.5.4 Cause che portano ad accumulo di radicali liberi 22
1.2.5.5 Danno ossidativo al DNA 23
1.2.5.6 Danno ossidativo e invecchiamento 24
1.2.6 Teoria della senescenza cellulare 28
1.2.7 Teoria del doppio agente 311.3 INTERVENTI ANTI-INVECCHIAMENTO 35
1.3.1 Restrizione calorica 35
1.3.2 Antiossidanti 36
1.3.3 Altri agenti in grado di prolungare la durata di vita in organismi modello 37
1.3.4 Attivatori delle sirtuine 37
1.3.4.1 Le sirtuine 38
1.3.4.2 Le sirtuine come target terapeutici per il trattamento di patologielegate all’invecchiamento 44
1.3.5 Resveratrolo 45
2. SCOPO DELLA RICERCA 48
3. MATERIALI E METODI 49
3.1 COLTURE CELLULARI 49
3.2 ANALISI AL MICROSCOPIO 51
3.2.1 Saggio della β-galattosidasi 51
3.2.2 Misurazione dell’autofluorescenza 51
3.3 COMET ASSAY 52
3.3.1 Comet assay: procedura 52
3.3.2Preparazione dei vetrini 53
3.3.3 Preparazione dei campioni 53
3.3.4 Lisi in condizioni alcaline 54
3.3.5 Incubazione enzimatica 54
3.3.6 Elettroforesi in condizioni alcaline 55
3.3.7 Colorazione 56
3.3.9 Analisi statistica del danno al DNA 58
3.3.10 Analisi della morfologia dei nuclei 583.3.11 Misurazione del contenuto di DNA 58
3.4 DNA MICROARRAY 59
3.4.1 Estrazione RNA 59
3.4.2 Analisi quantitativa e qualitativa 60
3.4.3 DNA microarray 61
4. RISULTATI 65
4.1 SAGGIO DELLA β-GALATTOSIDASI 65
4.2 AUTOFLUORESCENZA CELLULARE 66
4.3 CURVE DI CRESCITA 67
4.4 COMET ASSAY 684.4.1 Danno al DNA 68
4.4.2 Contenuto di DNA 70
4.4.3 Dimensione dei nuclei 71
4.5 DNA MICROARRAY 72
6. BIBLIOGRAFIA 81
7. RINGRAZIAMENTI 95







1. L’INVECCHIAMENTO


DEFINIZIONE DI INVECCHIAMENTO

Negli ultimi decenni l’allungamento della vita media e della sua durata massima, l’elevata prevalenza di soggettianziani nella popolazione generale, specialmente nei paesi sviluppati, e l’incremento della spesa sanitaria e sociale ascrivibile alla cura ed all’assistenza degli anziani, hanno stimolato, sia nei ricercatori dell’area economico-sociale che in quelli dell’area biomedica, un particolare interesse nello studio dei processi dell’invecchiamento (Wachter e Finch, 1997; Weinert e Timiras, 2003).Nel XVIII secolo Lamarck differenziò due tipi di mortalità: morte accidentale (malattie, predazione ed incidenti) e morte naturale (invecchiamento), postulando che l’invecchiamento sia dovuto a cause intrinseche. Più tardi Weismann (Poulton et al., 1891) ipotizzò che la stessa attività cellulare normale è dannosa per l’organismo, e che questa porta alla sua distruzione, sia direttamente che...