ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA


La electroforesis en gel de agarosa es un método bastante utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. La agarosa es un polímero lineal extraído de algas marinas, en el cual las moléculas de ADN de doble cadena migran de manera inversamente proporcional al logaritmo en base 10 (log 10) de sus tamaños moleculares. Dado que el ADN estácargado negativamente debido a los grupos fosfato de la molécula, la migración en la cámara de electroforesis ocurre del polo negativo al polo positivo.
Entre los factores que afectan la tasa de migración del ADN en los geles de agarosa se incluyen: el tamaño del fragmento, concentración de agarosa, la conformación del ADN, voltaje aplicado y amortiguador utilizado.
Las moléculas de ADN de 50 pares debases (pb) a varias mega bases en longitud pueden ser separadas en geles de agarosa de varias concentraciones y configuraciones. Fragmentos pequeños de ADN (50 – 20000 pb) son separados en geles de agarosa corridos en configuración horizontal en un flujo eléctrico de fuerza y dirección constante. Bajo estas condiciones, la velocidad de los fragmentos de ADN decrece a medida que incrementa lalongitud de estos y es proporcional a la fuerza del flujo eléctrico.


ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida seforma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándoseasí una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros.
Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida, probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de proteínas, como paraser combinada con técnicas de inmunoelectrotransferencia. En la técnica de SDS-PAGE, se mezclan las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de 1,4 g SDS/g proteína. Los complejos proteína/SDS poseen una estructura elipsoideo de bastón, donde la cadena proteica es distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relación final carga/masa queda constante para las distintas proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína, y viceversa.ELECTROFORESIS ZONAL
En esta técnica, la muestra está obligada a desplazarse sobre un soporte sólido de papel, celulosa o gel. La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolución estabilizada con un medio que sirve de soporte.
La muestra se aplica sobre una tirade papel de filtro humedecido con una 2 disolución tampón, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampón. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolución tampón y en los que se hallan colocados los electrodos.
Se conectan los electrodos a una fuente de tensión continua y se...