Endotoxinas Bacterianas

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[pic]85[pic] ENSAYO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS
[pic][pic]Porciones de este capítulo general han sido armonizadas con lo textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa. Las porciones que no está armonizadas se marcan con los símbolos ([pic][pic]) para especificar este hecho.[pic]
El Ensayo de Endotoxinas Bacterianas (BET) es un ensayo que utilizalisado de amebocitos de cangrejo bayoneta (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus) para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias Gramnegativas.
Existen tres métodos para este ensayo: el método de gelificación o gel-clot, que se basa en la formación de gel; el método turbidimétrico, basado en el desarrollo de turbidez después de la reacción de un sustrato endógeno; y el métodocromogénico, que se basa en el desarrollo de color después de la reacción de un complejo péptido sintético-cromógeno. Poner en práctica para el ensayo cualquiera de los tres métodos. En caso de duda o controversia, la decisión final se toma en base al método gel-clot, salvo que en la monografía para el producto que se está probando se indique lo contrario. El ensayo se lleva a cabo de modo tal que se evitala contaminación con endotoxinas.

APARATO
Despirogenar todo material de vidrio y otros termoestables en un horno de aire caliente usando un proceso validado. [pic]1[pic] El tiempo y temperatura mínimos habitualmente utilizados es de 30 minutos a 250[pic]. En caso de utilizarse aparatos de plástico, como microplacas y puntas de pipeta para pipeteadores automáticos, utilizar el aparato queresulte estar libre de endotoxinas detectables y no interfiera en el ensayo. [NOTA—En este capítulo, el término “tubo” incluye a cualquier otro receptáculo, tal como un pocillo de microtitulación].


REACTIVOS Y SOLUCIONES DEL ENSAYO
Lisado de amebocitos— Un producto liofilizado obtenido del lisado de amebocitos (leucocitos) de cangrejo bayoneta (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). Estereactivo se refiere únicamente a un producto fabricado de acuerdo con las regulaciones de la autoridad competente. [NotA— El Lisado de Amebocitos reacciona a algunos beta glucanos además de las endotoxinas. Se encuentran disponibles preparaciones de Lisado de Amebocitos que no reaccionan a los glucanos: se preparan quitando el factor G que reacciona a los glucanos del Lisado de Amebocitos oinhibiendo el factor G que reacciona al sistema de Lisado de Amebocitos y puede usarse para el ensayo de endotoxinas en presencia de glucanos].

Agua para el Ensayo de Endotoxinas Bacterianas (BET)— Utilizar Agua para Inyectables o agua producida a través de otros procedimientos que no muestra ninguna reacción con el lisado utilizado, en el límite de detección del reactivo.

Lisado TS— Disolver elLisado de Amebocitos en Agua para BET, o en un amortiguador recomendado por el fabricante del lisado, removiendo con suavidad. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o congelado, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.


PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
Solución Madre de Endotoxina Estándar— Una Solución Madre de Endotoxina Estándar se prepara a partir de un Estándar de Referenciade Endotoxina USP que ha sido calibrado para el Estándar Internacional de la OMS para la Endotoxina. Seguir las indicaciones que figuran en el prospecto del envase y en la etiqueta para la preparación y almacenamiento de la Solución Madre de Endotoxina Estándar. La endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NotA— Una Unidad de Endotoxina (UE) USP es igual a una Unidad Internacional(IU) de endotoxina].

Soluciones de Endotoxina Estándar— Luego de mezclar enérgicamente la Solución Madre de Endotoxina Estándar, preparar diluciones seriales apropiadas de la Solución de Endotoxina Estándar, utilizando Agua para BET. Utilizar cuanto antes las diluciones para evitar la pérdida de actividad por adsorción.

Soluciones de Muestra— Preparar las Soluciones de Muestra disolviendo o...