Espectrofotometria



Práctica 6
Conocimiento de técnicas analíticas.
parte I: FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRIA




Introducción

Para el estudio de biomoléculas es necesaria una técnica analítica que arroje datos cualitativos y cuantitativos así como el comportamiento físico-químico y biológico. Uno de los métodos que resultan mayormente eficientes para esta tarea es la espectroscopía y en particularlas espectroscopía de luz UV –visible.
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura,fuerza iónica, constante dieléctrica)
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla . Esto en la naturaleza, permite formar ciclos vitales como la fotosíntesis; cuando la energía es absorbida en forma de luz, hay un cambio en la energía basal E1 a un estado mayor de energía E2 (estado excitado), y solo será absorbida la energía que permita este “salto”.
Cada molécula tiene unaserie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula -esto es, su espectro de absorción- constituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental.
Al hacer pasar un haz de luz con una ondade intensidad I0 de forma perpendicular a la muestra en el espectrofotómetro, que debe de ser la disolución de un compuesto químico que absorba luz o cromóforo , parte de esta radiación será absorbida por el compuesto (Ia) mientras otra porción saldrá de la muestra (It), así se cumple.
La transmitancia de una sustancia es la relación que hay entre la luz que incidió en el espectrofotómetro y lacantidad de luz que se registra una vez atravesada la muestra, esto se expresa de la siguiente manera.
La absorbancia es la medida de luz absorbida por el compuesto en disolución y se define como el logaritmo de 1/T, entonces.
La ley de Lambert-Beer expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:Procedimiento Experimental

Material
1 Espectrofotómetro
2 celdas espectrofotométricas
4 vasos de precipitados de 50 ml
6 tubos de ensayo (15 mL)
1 pipeta graduada de 10 mL
1 pipeta graduada de 1 mL
1 propipeta (o jeringa con tubo latex)
Se trabajó con una solución de I3- de concentración 2x10-4 M. Para la preparación de la solución se utilizó una ya existente de concentración 2x10-3 M. Sudilución fue necesaria porque la capacidad de análisis del equipo no permite usar concentraciones tan altas.
Se calibró el espectrofotómetro con la solución de referencia (agua destilada) y se inició la determinación de la absorbancia de la especie en cuestión a distintas longitudes de onda. Con ayuda de la gráfica absorbancia vs. longitud de onda se eligió la longitud de onda a la que se trabajaría enla segunda parte de la práctica.
Se prepararon 4 disoluciones a diferentes concentraciones molares y se determinó la absorbancia para cada disolución preparada, introduciendo siempre, antes de cada medición, la solución de referencia en la celda del espectrofotómetro. Se registraron los resultados en las tablas 1 y 2.
Resultados y análisis

Barrido del espectro de absorción
La ley deBeer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se ha producido absorción. El “medio” en esta práctica lo constituyó una solución de yodo en agua de 2 x 10-4 M. El blanco utilizado en el espectrofotómetro fue agua destilada. Se tomaron varias lecturas de absorbancia con el espectrofotómetro a diferentes longitudes de onda. De...