Estudio cinético de la Sacarasa

Trabajo Práctico Experimental
Estudio cinético de la sacarasa


Objetivos
Determinar los parámetros cinéticos de la enzima sacarasa, entendiendo por parámetros cinéticos la velocidad máxima (Vm) y la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es igual a ½ de la velocidad máxima (Km).
Palabras claves: enzimas, sacarasa, parámetros cinéticos
Introducción
La sacarasaes una enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis de la sacarosa liberando glucosa y fructosa. Se encuentra en el lumen de las células epiteliales de las paredes intestinales, en levaduras y en células vegetales.

Los glúcidos liberados por la acción de esta enzima son de reducir en medio alcalino al acido pícrico (color amarillo) convirtiéndolo en ácido picrámico (color rojo-anaranjado). Laintensidad de la coloración obtenida, medida a través de un espectrofotómetro, es proporcional a la cantidad de glúcidos reductores presentes en la muestra.
La ecuación que representa lo mencionado anteriormente, se detalla a continuación:


Materiales y métodos

Materiales:
Extracto enzimático
Solución de sacarosa 2 %p/v
Hidróxido de Sodio
Solución de Ácido pícrico
Aguadestilada
2 pipetas
7 tubos de ensayo
Métodos:
Lo primero que hicimos fue tomar cada tubo numerado y agregar las cantidades indicadas en la guía de agua destilada respectivamente:
Tubo N°1: 9,5ml
Tubo N°2: 9ml
Tubo N°3: 8,5ml
Tubo N°4: 6,5ml
Tubo N°5: 4,5ml
Tubo N°6: 2,5ml
Tubo N°7: 0ml
Posteriormente, vertimos la cantidad indicada de Solución de Sacarosa 2% p/v en cada tubo de ensayo:
TuboN°1: 0ml
Tubo N°2: 0,5ml
Tubo N°3: 1ml
Tubo N°4: 3ml
Tubo N°5: 5ml
Tubo N°6: 7ml
Tubo N°7: 9,5ml.
Luego, agregamos a cada tubo 0,5ml de extracto enzimático (preparado con 1,5g de levadura de cerveza en 100ml de agua destilada) llevando la solución final contenida en cada uno a 10ml.
Una vez obtenido las siete soluciones, mezclamos mediante agitación cada una de ellas y llevamos a incubar atemperatura ambiente por 15 minutos.
Concluido el paso anterior, rápidamente agregamos 1ml de Hidróxido de Sodio al 10% p/v a cada muestra y además, 2ml de una Solución de Ácido Pícrico concentrado (ss) (ml).
Finalmente, agitamos los tubos hasta obtener un color uniforme amarillento y colocamos cada uno de los preparados en agua hirviendo (100°C) por cinco minutos. Al pasar el tiempo observamosun degradé de amarillo anaranjado hasta rojo oscuro. Debido a la falta de un espectrómetro para medir la absorbancia, los datos nos fueron dados.

Fundamentos:
Empleamos en el trabajo una solución de sacarosa (2% p/v), ya que nuestro objetivo es analizar la enzima sacarasa en cuanto a la determinación del tipo de cinética que sigue la enzima Sacarasa y sus parámetros cinéticos (Km y Vm).Necesitamos para que haya afinidad entre el sustrato y la enzima.
La temperatura de incubación fue a temperatura ambiente y por un periodo de 15 minutos por falta de materiales, pero sin embargo esta se pudo realizar óptimamente debido a que la temperatura ambiente era relativamente idónea para esta enzima.
Para detener la reacción, la hidrólisis de sacarosa catalizada por la enzima sacarasadurante la incubación, se utiliza el hidróxido de sodio que a su vez favorece a que se produzca un medio alcalino donde se pueda realizar el perfecto funcionamiento de los glúcidos reductores sobre el ácido pícrico.
El ácido pícrico en presencia de glúcidos de capacidad reductora cambia a ácido picrámico (color anaranjado/rojo). Cuanto más oscuro se torne el color de la solución, mayor será la cantidadde glucosa y a su vez mayor su absorbancia.
Lo mencionado anteriormente nos permite determinar que existe una relación entre la concentración de glucosa y la absorbancia de la solución. El gráfico que luego se presentará en el trabajo práctico demostrará dicha observación.
Resultados
Como ya se ha mencionado anteriormente, los datos de la absorbancia se nos fue dado. A los resultados dados,...