Extracción, Cuantificación y Análisis Electroforético de un ADN Plasmídico, Obtenido a Partir de Escherichia Coli con el vector pUC19

Extracción, Cuantificación y Análisis Electroforético de un ADN Plasmídico, Obtenido a Partir de Escherichia Coli con el vector pUC19


Departamento Académico: Biotecnología
Introducción
Un vector de clonación consiste en un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de ADN que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y se expresa. Losplásmidos constituyen uno de los sistemas de vectores más sencillos de utilizar, por lo que son de gran interés en la ingeniería genética (Puerta & Ureña, 2005).
El método de aislamiento de ADN bacteriano de naturaleza plasmídica se conoce como miniprep. Muchos de los plásmidos utilizados en la actualidad se replican en alto número de copias en Escherichia coli. Posterior al cultivo, lasbacterias son cosechadas por centrifugación y lisadas mediante alguno de los métodos reportados para este fin (Yero & López, 2009).
Los procedimientos para minipreparaciones de plásmidos más comunes utilizan la lisis alcalina, en la que se utiliza una solución con NaOH y SDS; y la lisis con lisozima, que consiste en el tratamiento de las células con la enzima, seguidamente son expuestas a undetergente, y son lisadas por calentamiento o por un tratamiento con álcalis. Posteriormente, la separación entre los restos celulares y el ADN se logra por precipitación mediante la adición de una solución de acetato de sodio. Para el trabajo rutinario en laboratorio, la extracción con un mezcla de fenol y cloroformo y la posterior precipitación con etanol, son suficientes para lograr plásmidos de calidadnecesaria (Zárate et al., 2009; Yero & López, 2009).
Para la determinación de la concentración de ácidos nucleicos en una determinada solución, existen dos técnicas principales, espectrofotometría y la cuantificación por comparación en electroforesis. La espectrofotometría permite conocer la concentración de ácidos nucleicos mediante la medida de su absorción de luz, tomando en cuenta que laabsorbancia de los ácidos nucleicos es máxima a 260 nm, debido a que las bases púricas y pirimídicas de los ácidos nucleicos tienen la propiedad de absorber la luz UV a esta longitud de onda. A 260 nm, una disolución con una concentración de 1 µg/ml presenta una absorbancia de 50 unidades ópticas si es ADN de cadena doble, 40 unidades ópticas si es ARN y 33 si es ADN de cadena sencilla. Además, laspreparaciones puras de ADN y ARN tienen una relación de D.O. 260/280 nm de 1,8 y 2,0 respectivamente (Puerta & Ureña, 2005; Jiménez, 2003).

Procedimiento
Los procedimientos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Manipulación Genética, ubicado en las instalaciones del Centro de Investigación en Biotecnología-FEMSA del ITESM, en los días comprendidos del 4 al 18 de setiembre del 2013.
a.Preparación cultivo bacteriano
Se preparó 2mL de ampicilina 1000X, disolviendo 100 mg de ampicilina sódica (IBI Scientific) en 2mL de agua ultra pura. Posteriormente se preparó 50mL de medio Luria-Bertain (LB) (Amresco®), disolviendo 1,25g de LB en 50mL de agua destilada, luego se autoclavó por 15 minutos a 121°C; 15psi. En campana de flujo laminar, se agregó (al medio de cultivo LB estéril) 50µL deampicilina 1000X, filtrándola a través de un filtro para jeringa. Luego se le adicionó 50µL de E. coli transformada con el plásmido pUC19, y se dejó incubar en agitación por 24 horas.
b. Mini preparación de plásmido
Para el ensayo mini preparación de plásmido, se siguieron las indicaciones del fabricante del kit “AxyPrep Plasmid Miniprep Kit”; para este ensayo se realizaron las siguientesmodificaciones:

1. Se variaron los volúmenes de cultivo bacteriano, de manera que los miniprep se prepararon según se indica en la siguiente tabla:
Muestra
Volumen cultivo bacteriano (mL)
1A
2
2A
4

2. Se omitieron los pasos de lavado 6 y 8.
c. Cuantificación y análisis electroforético del ADN plasmídico
Para la cuantificación del ADN plasmídico se siguieron las indicaciones del...