extraccion de ADN plasmidico de Escheriquia Coli

Extracción de ADN plasmídico de Escherichia Coli y Electroforesis en geles de agarosa
Fecha de entrega: 09/05/2014
Grupo 3:

Subcomisión TP 9, viernes 14hs-18hs.



Introducción a la Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires

Introducción:
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN extra cromosómico (ADN doble cadena)presentes en bacterias y algunas células eucariotas. Estos no son esenciales para la vida de la bacteria, pero contienen genes que le confieren características y adaptaciones adicionales, las cuales permiten la supervivencia y adaptación de la bacteria frente a situaciones externas particulares (en presencia de un antibiótico) o en competencia con otros microorganismos.
Los plásmidos se replican demanera independiente al DNA cromosómico, teniendo su propia maquinaria replicativa. Así mismo, el número de copias de cada plásmido es regulado, y se los puede clasificar como “plásmidos con bajo/mediano/alto número de copias”.
Por otro lado, los plásmidos poseen tres isoformas distintas (topoisómeros): circular superenrollada o “CCC” (dentro de la bacteria), circulares abiertas o “CA” (cuandouna de sus hebras es cortada y por lo tanto se pierde el superenrrollamiento) y finalmente como un fragmento lineal (cuando sus dos hebras son cortadas y se forma una molécula lineal).
Los plásmidos son utilizados frecuentemente en la biología molecular para la clonación de un gen de interés. Se los denomina “vectores de clonado” a aquellos plásmidos los cuales se les incorpora una porción deDNA foráneo (DNA genómico o DNAc “inserto”) con el fin de clonar y amplificar dicho gen de interés para estudiarlo. Por otro lado, un plásmido puede ser utilizado como “vector de expresión”. En este caso, además de poseer DNA inserto, se coloca un promotor (eucariota o procariota) o secuencias reguladoras encargadas de regular la expresión de dicho gen, es decir de su transcripción.
El términoelectroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos etc.) existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en función de su carga, peso y forma cuando se aplica un voltaje a travésde los electrodos.
La electroforesis en gel de agarosa es un método cuyo objetivo es medir el peso molecular (PM) de estas macromoléculas. Las moléculas cargadas son sometidas al campo eléctrico, y luego de un determinado tiempo, se observa su migración sobre el gel. Esta migración dependerá del la relación entre el tamaño, la carga y la forma de la molécula en observación.
En el caso de DNA,su carga neta es negativa debido a su esqueleto de grupos fosfatos, por lo tanto las moléculas migrarán hacia el ánodo (polo positivo). Cuando son sometidas al corrimiento en el gel de agarosa, las moléculas poseen dos fuerzas opuestas que determinan su velocidad: por un lado la fuerza eléctrica que ejerce el ánodo, y por otro la fuerza de rozamiento (Froz=m.ac) que actúa entre el gel y lasmoléculas. Es esta última la cual determina la velocidad de desplazamiento de los ácidos nucleícos, ya que la relación carga/masa en el DNA se encuentra igualada.

Materiales y métodos:
En preparación del ADN plasmídico se siguieron los pasos de la guía (en el paso 7 se centrifugo 15 minutos). Procedimiento:
Lisis y desnaturalización: las hebras del ADN plasmídico quedan asociadas (no separadascompletamente).
Renaturalización (abrupta) de la solución plasmídica: en forma en que las hebras del ADNp se vuelven a aparear como doble cadena.
Precipito el plasmído:
En la electroforesis mediante un gel de agarosa se cumple con los pasos que se especifican en la guía.











Resultados y observaciones:


Figura 1: observación del gel de agarosa expuesto a la luz UV luego...