Extracción De Adn En Muestras Biológicas

EXTRACCIÓN DE ADN EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

MATERIALES Y REACTIVOS:
Materiales y/o reactivos. | Cantidad (por mesa). |
Pipetas Pasteur. | 3 |
Baño María | - |
Centrífuga | - |
Tubo de ensayo tapa rosca | 1 |
Gradilla | 1 |
Pipetas de 1 y 5ml. | 1 |
Toallas de papel. | 2 |
Porción de papel aluminio | - |
Solución de SDS al 1% en NaOH 0,2N. | 5ml |
Etanol absoluto frío. | 10ml|
Tritón X100 al 1% | 10ml |
NaCl 0,1M | 5ml |
Amortiguador salino (NaCl 0,15M; Citrato de Sodio 0,015 M, pH 7). | 1ml |
Agua destilada | 10ml |
Sangre Humana extraída con EDTA. | 3-5ml |
PROCEDIMIENTO:
Extracción de ADN Humano:
1. Tomar una muestra de 3 a 5ml de sangre en un tubo vacuntainer con EDTA.
2. Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Separar la capa de glóbulos blancos quese encuentra en medio del plasma y los glóbulos rojos.
3. Pasarlas a otro tubo de ensayo y agregar 10ml de agua destilada, tapar el tubo e invertirlo tres veces.
4. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm descartar el sobrenadante.
5. Al sedimento (pequeño botón blanco), se le agregan 10ml de tritón X100 al 1%. Tapar el tubo y agitar suavemente de manera constante durante unos minutos hastaresuspender perfectamente el sedimento.
6.Centrifugar 10 minutos a 5000rpm, descartar el sobrenadante.
7. Al sedimento se le agregan 5ml de SDS al 1% (agitar suavemente y resuspender el botón). Pasar el contenido a un tubo de ensayo con tapa y agitar suavemente durante unos minutos más.
8. Agregar 5ml de NaCl 0,1M agitar y dejar reposar por unos minutos.
9. Agregar 10ml de etano frío. Agitar muysuavemente y observar como se precipitan los filamentos de ADN
10. Colectar el ADN con una punta para micropipeta de 10µl a 100µl (punta amarilla) y llevarlo a un tubo que contenga 4ml de amortiguador salino.
11.En caso de que no se pueda colectar el ADN con la punta, se procede a centrifugar 5 minutos a 3000 rpm, se descarta el sobrenadante y al sedimento se le agregan 4ml de amortiguador.

TIPOSDE MUESTRAS BIOLÓGICAS
Muestra biológica estándar: Hisopo (saliva)
Es el modo de recoger muestras de ADN de forma estándar y consiste en la utilización de HISOPOS o TORUNDAS estériles (bastoncillo de algodón parecido a los de la limpieza de las orejas).
Es un método indoloro y no invasivo. Se frota el interior de las dos mejillas de la boca, unas 25-30 veces cada mejilla. Después se deja secarel hisopo una hora al aire libre, apoyándolo encima de un vaso. Y, finalmente, se recoge en un sobre de papel preparado para este uso.
La utilización del hisopo tiene las siguientes ventajas:
* Se puede conservar el ADN recogido varios meses a 4 ºC en un lugar seco y en la oscuridad.
* Se transporta fácilmente.
* Es muy discreto.
* La obtención de ADN es sencilla y rápida
Estetipo de técnica es nuestra manera de recoger muestras de ADN de forma rutinaria y estándar, por lo que todos nuestros Kits contienen hisopos estériles por duplicado para cada participante.
La recogida de ADN mediante extracción de sangre ya no se encuentra en uso, ya que es una metodología invasiva y frecuentemente dolorosa. En ciertos casos es bastante problemático utilizarla (Ej. recién nacidos opersonas con ciertas enfermedades).
Muestra biológica NO estándar: Muestra forense
En los casos en que se necesita más confidencialidad o cuando el participante sea de difícil acceso, las muestras biológicas forenses son un buen modo de obtención. Las principales muestras que utilizamos son las siguientes:
* Manchas de sangre
* Colillas
* Chicles
* Cabello o pelos arrancados conraíz (un mínimo de 5 unidades)
* Esperma
* Saliva
* Pañuelos con mucosidades nasales
* Bastoncillos para la limpieza de las orejas
* Residuos de máquina de afeitar eléctrica
* Cepillo de dientes
* Palillos
* Uñas
* Vellosidades coriales
* Líquido amniótico
* Dientes
* Huesos
* Fluidos corporales
* Otros

Principales componentes de la...