Extracción de ADN por el método propuesto por Saghai Maroof.

4.2 Extracción de ADN

La extracción de DNA se realizó usando el método propuesto por saghai-maroof et al (1984), con algunas adaptaciones para el género.

1. Previamente se realizo molienda connitrógeno líquido en mortero del tejido vegetal, se pulverizaron 2 gr por muestra en tubos de 15 ml a los que se les agregó 9 ml de buffer de extracción [1 ml de Tris 1M pH 7.5; 1.4 ml de NaCl 5M;1ml de EDTA (Tetracetato de etilendiamina) 0.5M pH 8.0; CTAB 1 % (bromuro de alquiltrilmetilo de amonio mixto; 0.1 ml de BME 14M (-mercaptoetanol)], calentado previo a su uso a 65 ºC en la incubadoraFisher Biotech Hybridization Incubator FBHI10, permitiendo que el tejido entre en contacto con la solución, e incubando a 65°C por 60 minutos con una agitación ligera en intervalos de 10 minutosdurante el periodo de incubación.
2. Transcurrido el tiempo se dejó enfriar y se agregó cloroformo-alcohol isoamilico 24:1 hasta nivel de 14 ml, con agitación por 20 minutos a 15-20 revoluciones,después se centrifugaron por 10 minutos a 3000 rpm, a temperatura ambiente, se transfirió el sobrenadante a nuevos tubos y se repitió el lavado con cloroformo-alcohol isoamilico.
3. En nuevos tubos seadicionaron 30 μl de RNAsa (10 mg ml-1) y se añadió el sobrenadante del segundo lavado de cloroformo a dichos tubos y se dejó actuar a la RNAsa por 45 minutos a temperatura ambiente.
4. Después seañadió un volumen de isopropanol (aproximadamente 7 ml), con una agitación muy tenue y se almacenaron por 20-30 minutos a -20 °C para propiciar la precipitación del DNA.
5. Se procedió a centrifugar a3000 rpm por 5 minutos para formar una pastilla, se decanto la fase acuosa y se obtuvo un sedimento blanquecino en el fondo del tubo, este se dejo secar a temperatura ambiente por un periodo de 2 horasaproximadamente y se disolvió en 1 ml de TE-8 y se conservo a 4 °C toda la noche.
6. Para la precipitación se adicionaron 50μl de NaCl y 2 ml de etanol absoluto al 100 %, con la ayuda de ganchos...