Extracción de ARN

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y FORESTALES.
BIOTECNOLOGÍA.



INFORME LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR IV, EXTRACCIÓN DE ARN.

ORLANDO BARRA
EDUARDO PACHECO
ANDREA SOBARZO

PROFESORES:
GRACIELA BERRIOS


TEMUCO – CHILE
2014
INTRODUCCIÓN
En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis de proteínas, puesaunque el ADN es el que contiene la información que determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta información y producir las proteínas necesarias para el desarrollo y actividades de la célula.
La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren co-factores para su función. Por lotanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-pirocarbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente.
La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el método descrito por Chomezynski y Sacchi (1), el cual se basa en el aislamiento de este ácido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimientodebe realizarse una etapa de homogenización de la muestra con el (los) reactivo (s) que contengan la solución fenol-isotiocianato, donde este último se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las células y disuelve sus componentes, la adición posterior de cloroformo separa la solución en fase acuosa y orgánica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa esposteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitación el ARN.
La metodología que se va a utilizar en esta práctica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se mencionó, igualmente el ADN y las proteínas pueden ser recuperados de la fase orgánica por precipitación secuencia, así con etanol se logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitación adicional puedenrecuperarse las proteínas de la fase orgánica.

OBJETIVOS GENERALES
-Conocer y analizar el procedimiento de la extracción de ARN, a partir de Deschampsia Antarctida.

-Familiarizar al estudiante con metodologías y normas de trabajo, en un laboratorio de Biología Molecular aplicando siempre el conocimiento obtenido previo gracias a la lectura de la guía de trabajo otorgadas por el profesor.OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-Conocer la razón por la cual utilizamos cada reactivo presente en el protocolo.

-Lograr generar una opinión consistente de los resultados de las extracciones de ARN y como estas se observan en los resultados de la electroforesis.


EXTRACCION DE ARN

Para la extracción de ADN genómico seguiremos el protocolo, valga la redundancia de “extracción de ARN”,utilizando la planta; Deschampsia Anthártica, la cual nos proporcionará el material biológico a estudiar, a diferencia de los animales las plantas tienen en su célula una estructura que se conoce como pared celular la cual tiene como función proteger y dar a la planta resistencia a diversos estímulos mecánicos, además de proveerle una forma rectangular. Para lograr obtener el material genético debemosromper la membrana y la pared celular, la cual está conformada en mayor proporción por celulosa, un polisacárido muy resistente. A diferencia de la extracción de ADN genómico en células animales, aquí es necesario aplicar temperaturas muy bajas que nos faciliten la destrucción de esta rígida pared, lo cual se logra utilizando nitrógeno liquido.


Protocolo de extracción RNA ChomczynskiAntes de comenzar encender y preparar centrifuga a 4ºC


1-Pulverizar el tejido (100 mg. aprox.) en un mortero con la ayuda de nitrógeno líquido (-196°C): El nitrógeno líquido tendrá como función detener todas las reacciones que se estén llevando a cabo en ese preciso momento en la célula, también cumple la función de cristalizar las células y en conjunto con la acción mecánica generada por la...