Extracción De Rna Y Síntesis De Cdna

Extracción de RNA y Síntesis de cDNA de la Hormona de Crecimiento en Mus sp.
Asignatura: Temas Selectos de Biología Molecular


Introducción y marco teórico

El trabajo se puede dividir en dos partes:
Extracción de mRNA
Normalmente una célula promedio de mamífero contiene cerca de 102 picomoles de RNA mensajero, de los cuales solo un 80-85% son de RNA ribosomal. Otro 15-20% son moléculasde bajo peso molecular, como lo son tRNA y RNA nuclear pequeño. Tan solo de 1-5% corresponde al mRNA. En células eucariotas, estas moléculas tienen una secuencia Poli-A en su sección terminal 3’. Dentro de una célula, la poli-A tiene una función de protección del RNA contra la degradación, pero en ingeniería genética es útil para otros propósitos, como la separación y purificación del mRNA.(Sambrook & Russell, 2001)
Uno de los conflictos más comunes al trabajar con RNA es su alta reactividad ya que posee dos grupos hidroxilos más que el ADN (2’ y 3’). Aún más común es que la molécula se degrade por la acción de RNasas, las cuales rompen enlaces fosfodiéster entre ribosas (Nelson & Cox, 2004). Las RNasas son liberadas por células epiteliales muertas en la piel, que se encuentraen constante descamación. Por ello se ha vuelto necesario tener precauciones para evitar contaminación. La utilización de guantes, cubrebocas y trabajar en un área desinfectada ayudan a disminuir la probabilidad de errores. (Sambrook & Russell, 2001)
Debido a la inestabilidad del RNA, los protocolos para su extracción utilizan sales de guanidina, como el tiocianato de guanidinio (GITC) y elcloruro de guanidinio (GndCl). Además de lisar las células, estos compuestos también desnaturalizan las RNasas endógenas (Sambrook & Russell, 2001). El guanidinio (Gnd+) es el desnaturalizante de proteínas más poderoso normalmente utilizado, mientras el tiocianato (SCN-) tiene la misma función, además de neutralizar cargas positivas en moléculas como la lisozima (Manson et al. 2003).
Algunosde los protocolos más utilizados son:
* Chirwing et al. (1979). El cual sirve para tejido adiposo rico en triglicéridos. El material lisado con GITC, se atraviesan colchones de CsCl, volviendo las moléculas de rRNA y el mRNA más pesadas que las otras demás. Al centrifugar, el RNA habrá precipitado, mientras la proteína y el ADN permanecerán en las fases superiores. Su desventaja es queconlleva más pasos, empezando por la utilización de la ultracentrífuga y colchones de CsCl, por ello fue desplazado por métodos más rápidos. (Sambrook & Russell, 2001)
* Chomczynski & Sacchi (1987) Para la lisis utiliza una solución desnaturalizante con GITC, pero la gran diferencia con el anterior es que el RNA no será precipitado, sino que se mezclará con fenol/cloroformo/alcoholisoamílico a un pH ácido. El ADN permanece en la fase acuosa a pH de 7-8, pero es retenido en la fase orgánica a pH de 5-6, mientras el RNA se conserva en la fase acuosa. (Thermo Scientific)
* Chomczynski (1993) propuso otro protocolo en donde se pueden separar proteínas y ADN utilizando una solución monofásica de GITC y fenol, como lo son Trizol, TRI, Isogen u otros reactivos comerciales. Es importanteestandarizar adecuadamente estas medidas, ya que se puede incurrir en la contaminación por polisacáridos y proteoglicanos. (Sambrook & Russell, 2001)
* Otros protocolos precipitan el RNA con iones de litio en soluciones de LiCl, pero al finalizar la extracción debe asegurarse que se encuentre libre de iones de cloro, ya que evitan que se adhiera la transcriptasa inversa (en caso de desearsintetizar cDNA). Eso se puede lograr con productos comerciales para dializar el RNA. (Thermo Scientific)
Un punto clave para evitar errores es que todos los reactivos utilizados se hagan con H2O tratada con dietilpirocarbonato (DEPC), para evitar RNasas exógenas en la muestra (Thermo Scientific). También en todos los casos se recomienda congelar o moler el tejido, enfriando con nitrógeno...