Extraccion de rna

A11. Extracción de ARN por el método del TRIZOL® Reagent
Reagentes requeridos:
Cloroformo.
Alcohol isopropílico.
Etanol al 75 % (en agua tratada con DEPC).
Agua libre de RNasa o soluciónSDS 0.5 %.
Para 50-100 mg de tejido vegetal:
• Pulverizar en presencia del nitrógeno líquido, en morteros totalmente estériles y tratados con Etanol-DEPC 0.02 % (v/v).
• Colectar las muestras entubos eppendorf estériles y tratados con Etanol-DEPC 0.02 % (v/v).
• Homogenizar las muestras (congeladas con nitrógeno líquido) con 1 mL del reactivo TRIZOL por cada 50-100 mg de tejido empleado. Elvolumen de la muestra no debe exceder el 10 % del volumen del TRIZOL.
• Incubar las muestras homogenizadas a temperatura ambiente durante 5 minutos
• Centrifugar las muestras homogenizadas a 12 000rpm durante 15 minutos a 4 °C.
• Transferir el sobrenadante (fase acuosa) a un tubo nuevo estéril y tratado con Etanol-DEPC 0.02 % (v/v) e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
• Agregar 200μL de cloroformo por 1 mL de TRIZOL empleado.
• Agitar vigorosamente por inversión durante 15 segundos e incubar nuevamente de 2 a 3 minutos a temperatura ambiente.
• Centrifugar a 12 000 rpmdurante 15 minutos a 4 °C. El RNA permanece exclusivamente en la fase acuosa.
• Transferir la primera fase (la fase acuosa) a un tubo nuevo, estéril y tratado con Etanol-DEPC 0.02 % (v/v) y precipitar elRNA con 500 μL de alcohol isopropílico por cada mililitro de TRIZOL consumido, mezclar por inversión e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
• Centrifugar a 12 000 rpm y 4 °C por 10 minutos.Remover el sobrenadante y lavar el pellet (RNA) con 1 mL de etanol al 75 % por cada mililitro de TRIZOL utilizado, mezclar con vórtex y centrifugar a 7 500 rpm durante 5 minutos a 4 °C.
• Dejar secar elRNA (colocar el tubo en una sanita) por no más de 10 minutos y disolver en agua libre de RNasas (20-40 μL). Calentar 10 minutos a 55-60 °C y transferir inmediatamente a hielo. El RNA deberá ser...