Extracción De Tirosinasa

1. Objetivo
Conocer el proceso del pardeamiento enzimatico, y saber el papel que desempeña la proteina Tirosinasa en él.
Extraer la enzima Tirosinasa de una fruta o vegetal.
Determinar su punto isoelectrico, midiendo su pH.

2. Introducción

El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene como substrato el oxígeno molecular, catalizada por un tipo deenzimas que se puede encontrar en prácticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. En el hombre es la responsable de la formación de pigmentos del pelo y de la piel. En los cefalópodos produce el pigmento de la tinta, y en los artrópodos participa en el endurecimiento de las cutículas del caparazón, al formar quinonas que reaccionan con las proteínas, insolubilizándolas. En losvegetales no se conoce con precisión cual es su papel fisiológico.

El enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato. También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubrióprimero en los champiñones, en los que el efecto de pardeamiento tras un daño mecánico, como el corte, es muy evidente.
Es un hecho de observación frecuente que las patatas, manzanas, plátanos y otras
frutas adquieren una coloración marrón al ser dañadas o cortadas. Esto se debe a la
conversión del aminoácido tirosina en el pigmento melanina .
La melanina es un pigmento que se halla en lamayor parte de los seres vivos. En los animales el pigmento se deriva del aminoácido tirosina. La forma más común de melanina es la eumelanina, un polímero negro-marrón de ácidos carboxílicos de dihidroxindol y sus formas reducidas.

El mismo proceso ocurre en la piel por exposición a la radiación ultravioleta. Las
reacciones enzimáticas son catalizadas por la tirosinasa (monofenol,dihidroxifenilalanina:
oxígeno oxidorreductasa; EC 1.14.18.1). La enzima se encuentra en el
interior del tejido vegetal y, dado que la reacción requiere O2, la reacción no ocurre
hasta que el interior no queda expuesto al exterior.
Estructura de las polifenoloxidasas
La polifenoloxidasa, EC 1.14.18.1 tiene dos actividades enzimáticas, una hidroxilando monofenoles (“cresolasa”) y otra oxidando difenolesa quinonas (“catecolasa”). Dependiendo de la fuente, la actividad “cresolasa” es mayor o menor, incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas las enzimas tienen actividad “catecolasa”.

La característica estructural más importante de estas enzimas es la presencia en su centro activo de dos átomos de cobre, unidos cada uno de ellos a tres histidinas, que se han conservado a lo largo dela evolución en todas las enzimas de este tipo, desde las bacterias al hombre. En su entorno se sitúan una serie de aminoácidos hidrofóbicos, con anillos aromáticos, que también son importantes en su actividad, para la unión de los sustratos.
La forma de actuación del enzima, con dos actividades distintas, ha sido un misterio, aclarado en parte hace relativamente pocos años. El enzima catalizados reacciones porque en el estado nativo se encuentra en dos formas distintas, la llamada met-tirosinasa, que es activa solamente sobre monofenoles, y la oxi-tirosinasa. Estas formas se interconvierten entre ellas, de forma acoplada al desarrollo de la reacciones que catalizan.

En los crustáceos (y en los insectos), la polifenoloxidasa se encuentra en forma de proenzima, inactiva, que esactivada por proteolisis por una proteasa endógena. Diversas sustancias producidas por microrganismos activan la proteolisis del proenzima y la formación de enzima activo.
La reacción de pardeamiento enzimático
El pardeamiento enzimático es un conjunto complejo de reacciones, que se inicia por la o las reacciones catalizadas de forma enzimática. La primera de ellas, cuando el sutrato presente...