Extracción y purificación de proteína de SARS

Peptides from the SARS-associated
coronavirus as tags for protein
expression and purification
(péptidos provenientes del coronavirus asociado al SARS -Síndrome
respiratorio agudo severo-, como marcadores para la expresión y purificación
de proteínas)


Química biológica - BIOTECNOLOGÍA

Desventajas de la detección y purificación de proteínas: protocolos complicados y de largos períodosde
tiempo.

Solución (para facilitar análisis, solubilidad y manipulación de proteínas):
- fusionarlas a largos patrones de fusión (ej.: proteína de unión maltosa de Esterichia Coli )
-Glutationa S Transferasa (ligandins-ADN)
-Pequeños

oligopéptidos

(Munro y Pelham).

Esto permite la detección y la purificación por afinidad de una proteína en la ausencia de un anticuerpo específicocontra una proteína tratada.
El uso de un marcador es una ventaja particular si no hay antisuero (anticuerpo) específico disponible. Por ejemplo:
proteínas que son poco inmunogénicas, transgen.
Ejemplos de detección y purificación de proteínas con un oligopéptidos como marcador:
-cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (oligohistidine tag).
-FLAG epitopo (porción de unamolécula que es reconocida por el sistema inmunitario): una pequeña secuencia del
ADN humano (específicamente del gen c-mym que regula la transcripción: activa la expresión de genes) que por
técnicas recombinantes de ADN es adherido a la proteína –sobre todo recombinantes- que se separa por sobre
expresión respecto de la de tipo salvaje.

MARCADO DE PROTEÍNAS CON UN PÉPTIDO:
Técnicacomúnmente usada para facilitar la detección y purificación de proteínas.
Permite: detección y la purificación por afinidad de una proteína en la ausencia de un anticuerpo específico contra
una proteína tratada.

La variabilidad con respecto al péptido marcador es esencial ya que no hay un único marcador que encaje en todos
los propósitos (desventajas):
-Presencia de una serie de histidinas: puedenhacer que la purificación de la proteína deseada marcada con histidinas
se vuelva difícil ya que el eluído podría contener impurezas de eventos de uniones menos específicas.
-El uso de un anticuerpo anti-His para la detección de proteínas en inmunoblot o en análisis de inmunofluorescencia
es problemático porque pueden ocurrir reacciones no específicas.

-El anticuerpo anti-FLAGpreferencialmente reconoce su epítopo cuando está expresado en las terminales N de las
proteínas.
-El anticuerpo de S-myc puede reaccionar de manera no cruzada con otras estructuras y unirse de forma no
específica.
-Fan et al, observó la detección de proteínas marcadas con c-mye, en análisis con inmunofluoresencia pero no podría
ser confirmada por Western Blot.
-Problemas en ciertos sistemas de expresión-Afectar la función de la proteína dependiendo del tamaño y composición de aminoácidos del marcador.

---> Por todo lo anterior se están haciendo constantes esfuerzos para conseguir sistemas alternativos de
marcadores de péptidos.
Este reporte describe el uso de dos péptidos cortos de proteínas
de la nucleocápside del coronavirus SARS-associated
(SARS-N) como marcadores de proteínas.
¿Quéhicieron ellos?:

-Generaron ANTICUERPOS MONOCLONALES
PROVENIENTES DE RATÓN (mAbs) dirigidos contra la
proteína de la nucleocapside (N) de los coronavirus (CoV) SARS.
-Identificaron péptidos de 10 aminoácidos como epítopos.
-Caracterizaron la mínima secuencia de la
epitopo y examinaron la aplicación de estos péptidos
como marcadores para proteínas de expresión en E. coli.
-Testearon laeficiencia de la purificación de proteínas
marcadas por medio de cromatografía de afinidad.
[CAPSIDE: estructura proteica dentro de la cual se encuentra el material
genético del virus.
SARS: Síndrome respiratorio agudo severo. Virus grande de ARN con
sentido 5’ – 3’. Tiene una envoltura derivada de las membranas intracelulares.]

Los plásmidos (ADN circular) para la generación de...