Extraccion Adn Bacteriano
Páginas: 6 (1470 palabras)
Publicado: 24 de octubre de 2012
Extracción DE ADN BACTERIANO
-------------------------------------------------
INTRODUCCIÓN
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un tipo de ácido nucleico, es decir, una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus y es responsable de su transmisiónhereditaria. Muchas de las técnicas de biología molecular incluyen algún tipo de manipulación del material genético. Hoy en día se puede obtener gran cantidad de ADN de buena calidad de manera sencilla.
Existen diferentes métodos para la obtención de ADN bacteriano, estos varían en duración y complejidad del procedimiento en función de la calidad del ADN que pretendemos obtener. Para la extracciónse requiere una serie de etapas básica. En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. Luego se debe romper también la membrana nuclear para dejar libre el ADN.
La purificación de ácidos nucleicos es un requisito imprescindible para realizar diversas técnicas de biología molecular. El método clásico de purificación deácidos nucleicos se basa en el uso de disolventes orgánicos tóxicos, siendo la extracción mediante fenol/cloroformo la más conocida.
No obstante, recientemente se han desarrollado métodos alternativos que emplean una alta concentración salina en vez de desproteinizar la muestra, sin los inconvenientes de toxicidad antes mencionados. Este sistema es conocido también con el nombre de “purificaciónsalina”. El primer paso se realiza mediante un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares. Dicha rotura celular se lleva a cabo en presencia de “conservantes”, que garantizan la integridad del ADN; esto es, que impiden o limitan la acción de las ADNasas presentes en las células o contaminantes del medio. El ARN presente se elimina mediante tratamiento con ARNasa. A continuación seeliminan las proteínas y otros contaminantes celulares, mediante precipitación salina. Finalmente el ADN genómico se asila mediante precipitación en presencia de alcohol y se disuelve en agua o en una solución tamponada que puede contener “conservantes” del ADN.
Hoy en día, todo el procedimiento mencionado anteriormente se lleva a cabo de manera simple por medio de los llamados “kits” los cualesoptimizan el tiempo y la calidad del ADN obtenido.
OBJETIVO GENERAL
* Aprender a usar un kit específico para aprender a extraer ADN genómico de cepas bacterianas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
* Extraer ADN genómico de cepas bacterianas, a través del uso de un kit específico para tal fin.
* Cuantificar el ADN extraído mediante fluorometría
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipos,materiales y reactivos:
Material Biológico:
* Caldo joven (24 h) de una cepa bacteriana de aproximadamente 107 células .mL‐1
Material Plástico:
* Guantes de látex
* Micropipetas de 10, 100, y 1000 uL, puntas estériles para esas micropipetas
* Microtubos estériles de 1.5 mL.
Reactivos:
* Alcohol 96%
* Agua destilada
Equipos:
* Baño María
* Microcentrífuga* Vortex
* Refrigeradora/congeladora
* Espectrofotómetro UV
* Mechero (Bunsen ó Fisher)
Procedimiento:
Preparar un baño maría a 55oC.
Extracción:
Purificación:
Cuantificación:
Fluorometría: Se calibró Fluorómetro, luego se realizó la lectura de soluciones estándar previamente preparadas. Para la lectura de la muestra, se tomó 10 uL de la solución de ADN obtenida dela extracción y se diluyó en 199 uL de buffer fosfato salino- fluorocromo 1 µl. Después se observó que la cubeta contuviera un volumen mayor a 200 uL. Finalmente se introdujo la cubeta en el fluorómetro y se realizó la lectura de la concentración que se dio en ng/mL.
RESULTADOS
Concentración de ADN por método fluorométrico:
En 1 µl de solución de ADN: 6.31 ng/ml
En 100 µl de solución...
-------------------------------------------------
INTRODUCCIÓN
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un tipo de ácido nucleico, es decir, una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus y es responsable de su transmisiónhereditaria. Muchas de las técnicas de biología molecular incluyen algún tipo de manipulación del material genético. Hoy en día se puede obtener gran cantidad de ADN de buena calidad de manera sencilla.
Existen diferentes métodos para la obtención de ADN bacteriano, estos varían en duración y complejidad del procedimiento en función de la calidad del ADN que pretendemos obtener. Para la extracciónse requiere una serie de etapas básica. En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. Luego se debe romper también la membrana nuclear para dejar libre el ADN.
La purificación de ácidos nucleicos es un requisito imprescindible para realizar diversas técnicas de biología molecular. El método clásico de purificación deácidos nucleicos se basa en el uso de disolventes orgánicos tóxicos, siendo la extracción mediante fenol/cloroformo la más conocida.
No obstante, recientemente se han desarrollado métodos alternativos que emplean una alta concentración salina en vez de desproteinizar la muestra, sin los inconvenientes de toxicidad antes mencionados. Este sistema es conocido también con el nombre de “purificaciónsalina”. El primer paso se realiza mediante un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares. Dicha rotura celular se lleva a cabo en presencia de “conservantes”, que garantizan la integridad del ADN; esto es, que impiden o limitan la acción de las ADNasas presentes en las células o contaminantes del medio. El ARN presente se elimina mediante tratamiento con ARNasa. A continuación seeliminan las proteínas y otros contaminantes celulares, mediante precipitación salina. Finalmente el ADN genómico se asila mediante precipitación en presencia de alcohol y se disuelve en agua o en una solución tamponada que puede contener “conservantes” del ADN.
Hoy en día, todo el procedimiento mencionado anteriormente se lleva a cabo de manera simple por medio de los llamados “kits” los cualesoptimizan el tiempo y la calidad del ADN obtenido.
OBJETIVO GENERAL
* Aprender a usar un kit específico para aprender a extraer ADN genómico de cepas bacterianas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
* Extraer ADN genómico de cepas bacterianas, a través del uso de un kit específico para tal fin.
* Cuantificar el ADN extraído mediante fluorometría
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipos,materiales y reactivos:
Material Biológico:
* Caldo joven (24 h) de una cepa bacteriana de aproximadamente 107 células .mL‐1
Material Plástico:
* Guantes de látex
* Micropipetas de 10, 100, y 1000 uL, puntas estériles para esas micropipetas
* Microtubos estériles de 1.5 mL.
Reactivos:
* Alcohol 96%
* Agua destilada
Equipos:
* Baño María
* Microcentrífuga* Vortex
* Refrigeradora/congeladora
* Espectrofotómetro UV
* Mechero (Bunsen ó Fisher)
Procedimiento:
Preparar un baño maría a 55oC.
Extracción:
Purificación:
Cuantificación:
Fluorometría: Se calibró Fluorómetro, luego se realizó la lectura de soluciones estándar previamente preparadas. Para la lectura de la muestra, se tomó 10 uL de la solución de ADN obtenida dela extracción y se diluyó en 199 uL de buffer fosfato salino- fluorocromo 1 µl. Después se observó que la cubeta contuviera un volumen mayor a 200 uL. Finalmente se introdujo la cubeta en el fluorómetro y se realizó la lectura de la concentración que se dio en ng/mL.
RESULTADOS
Concentración de ADN por método fluorométrico:
En 1 µl de solución de ADN: 6.31 ng/ml
En 100 µl de solución...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.