Extraccion ADN plasmidico

37. Purificación de ácidos nucleicos
Mª José Prieto Álamo, Juan López Barea, Carmen Pueyo de la
Cuesta
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

La purificación de DNA es un paso clave en la experimentación en
Biología Molecular. Los métodos de purificación de DNA se clasifican en
dos grandescategorías, según pretendan purificar DNA cromosómico o
DNA plasmídico. La purificación de DNA plasmídico es la base de
cualquier experimento de clonación molecular. El problema principal que
hay que resolver es la separación del DNA plasmídico y DNA
cromosómico. En esta práctica hemos elegido el método de “lisis
alcalina”, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. La
purificación de RNAes otro paso clave en la experimentación en Biología
Molecular. Cuando se trabaja con células de mamífero existen dos
posibilidades: purificar RNA total o mRNA (en base a la cola de poliA). La
purificación de RNA es la base de la cuantificación de transcritos en
estudios de expresión génica. En esta práctica purificaremos RNA
mediante el método “TRI-REAGENTTM”. El DNA plasmídico se purificaráa
partir de bacterias portadoras y el RNA a partir de células humanas
cultivadas en el laboratorio. Los ácidos nucleicos se separarán por
tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa y se visualizarán por
irradiación con luz UV en presencia de bromuro de etidio.
Palabras claves: plásmido, RNA, lisis alcalina, bacterias, células eucariotas,
electroforesis.

1. INTRODUCCIÓN YOBJETIVOS
1.1. Introducción
1.1.1 Purificación de DNA plasmídico
El genoma bacteriano se organiza en un único cromosoma circular con un
sólo origen de replicación. Las bacterias pueden contener información genética
adicional en forma de plásmidos. Los plásmidos son moléculas circulares de
DNA extracromosómico que se replican de forma autónoma, a partir de su
propio origen de replicación. Lainformación genética que portan los plásmidos
no es generalmente vital para la supervivencia celular. No obstante, dicha
información puede resultar imprescindible en determinadas circunstancias
ambientales, e.g. plásmidos portadores de genes de resistencia a antibióticos.
Las bacterias pueden llegar a tener un gran número de copias de un mismo
plásmido (plásmidos multicopia), facilitando enormementesu purificación.

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Hay distintos procedimientos para la purificación de DNA plasmídico, aunque
todos incluyen los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un
medio selectivo de aquellas que llevan el plásmido. (ii) Lisis de las bacterias
para la liberación del plásmido. (iii) Purificación del DNA plasmídico.
El problema principal que hay que resolver es la separacióndel DNA
plasmídico y DNA cromosómico. En esta práctica hemos elegido el método de
“lisis alcalina”, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad.
Lisis alcalina: Este método explota las diferencias en las propiedades de
desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico (pequeños
círculos de DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosómico
(fragmentado). La alcalinización conNaOH en presencia de un detergente
fuertemente aniónico (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalización del
DNA cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. Los
plásmidos se ven menos afectados por su pequeño tamaño y estructura
superenrollada. La neutralización del medio en presencia de una concentración
alta de sal (acetato potásico), provoca la precipitación delas proteínas (por el
tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potásica del dodecil
sulfato) y la del DNA cromosómico (por reasociaciones aleatorias
intracatenarias). Los agregados insolubles de proteínas y DNA cromosómico se
separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante
y conserva mayoritariamente su estructura nativa.
1.1.2 Purificación de...