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Extracción de DNA “miniprep” y geles de agarosa









RESUMEN

Realizamos una de separación de ADN plasmídico mediante dos técnicas. La primera de ella consistía en la desnaturalización de las moléculas de la muestra (pellet de bacterias E. Coli) mediante la utilización de soluciones con altos y bajos valores de pH, y su posterior centrifugación. A la hora de analizar lapureza de ADN de la muestra, medimos su absorbancia y obtuvimos una concentración de 2144,7 ug/ml. En la próxima visita al laboratorio, trabajamos con la misma muestra obtenida, le agregamos un colorante intercalante y expusimos a 100 V durante aproximadamente 60 min, para lograr la separación de los componentes de la muestra según su carga neta. Al observar bajo luz UV, pudimos contemplar las bandasformadas según la masa, carga y demás características y dedujimos si se trataba de ADN o ARN en casa caso.

















INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son replicones, es decir, poseen un origen de replicación donde se acopla ADN de otro organismo para clonarlo, y tienen la facilidad de replicarse de forma independiente del cromosoma, lo cual resulta muy favorable paranuestros fines en la manipulación del mismo. De todas formas, debe cumplir con una serie de requisitos tales como: bajo peso molecular, contar con un origen de replicación, poseer poly linkers (región con alto número de secuencias que son reconocidas por endonucleasas de restricción y degradadas), etc.
Resulta más favorable la utilización del ADN plasmídico en comparación con el ADN cromosómico, puestoque poseen un menor tamaño y se obtiene en forma circular cerrada covalentemente (CCC), lo cual evita que se desnaturalicen de forma completa ante una alteración externa.
Protocolarmente se realiza la lisis de las células con EDTA (solución 1), el cual es un agente quelante de iones metálicos que desorganiza la membrana externa e inhibe la acción de las nucleasas protegiendo así al ADN. Actúaen presencia de un azúcar (glucosa en este caso) que evite que la célula estalle, y del TRIS (Hidroximetil amino metano)que es un buffer biológico, cuya función es mantener el pH de la solución constante (pH 7.0- 8.0). Luego se somete a centrifugación para separar los componentes celulares y obtener el ADN plasmídico. Posteriormente, se realiza una desnaturalización alcalina con la utilización deuna solución con pH entre 12 y 12,5 (solución 2 en este caso) y se ven mayormente afectadas las moléculas lineales de ADN, las cuales se desorganizan por completo, mientras que las de conformación CCC lo hacen parcialmente. Se hace en presencia del SDS (Dodecil sulfato de sodio), un detergente aniónico que actúa como agente solubilizante de proteínas y de componentes de tejidos y membranas.Posteriormente se vuelve a bajar el pH para la renaturalización de los componentes de la muestra (solución 3 utilizada), y se produce una precipitación de ARN y ADN lineal no recuperado.
Al utilizar una solución de RNAsas se busca deshacerse de la mayor cantidad posible de ARN presente en la muestra, que también resulta un contaminante para nuestros fines. Se cuenta también con soluciones deCloroformo, que contribuye a la precipitación del ADN lineal no renaturalizado y del ARN sobrante, y de Isopropanol frío, a fin de descartar la mayor cantidad de contaminantes, y obtener ADN lo más “puro” posible.
Cuando analizamos los valores de absorbancia de la muestra podemos tener una idea de la pureza de la misma. El ADN posee un máximo de absorbancia a 260 nm, mientras que las proteínas lo poseena 280 nm. Esto quiere decir que si la relación A260/A280 tiene un valor entre 1,6 y 2, podemos hablar de ácidos nucleicos “puros”, y si en cambio su valor es menor a 1,6 hay una gran cantidad de proteínas “residuales” contaminantes. De todas formas, como todos los ácidos nucleicos poseen el mismo rango de absorbancia no puedo determinar con esta técnica si se trata de ADN o ARN con precisión....