EXTRACCION DE ADN

C. EXTRACTO DE DNA

RECOMEDACIONES

Clonación requiere una cantidad mínima (de 4 a 5 g) de ADN de buena calidad (limpio y no demasiado degradado). Por tanto, es necesario realizar varioslavados fenol y utilizar una cantidad relativamente grande de tejidos bien conservados (frescos, congelados o conservados en etanol al 100% durante unos días). Con el fin de facilitar la extracción, qué noponer demasiado tejido en un tubo: se recomienda utilizar varios tubos por especies con una cantidad limitada de tejido por tubo.


PROTOCOLO

 Preparación del tejido

Triturar el hielo en500 L de tampón de extracción * + 20 L de proteinasa K (10 mg / ml)

Incubar en un / incubadora de balanceo agitación durante 2 horas a 55 ° C
(o en un baño de agua con vórtex cada 30minutos)

Giran a 10 000 g durante 2 minutos para eliminar fragmentos grandes

Recuperar 400 L de sobrenadante

















Repita  Paso 2 si y siempre y cuando las impurezasesten presentes

* ETN-Urea: Tris-HCl 10 mM pH 8, NaCl 0,3 M, SDS 1%, EDTA 10 mM, urea 4 M o
«Wilson» tampón: Tris-HCl 100 mM pH 8, EDTA 10 mM pH 8, NaCl 100 mM, SDS 0,1%, ditiotreitol 50 mM Precipitaciones

Añadir 2 a 2,5 V de etanol al 100% a -20 ° C + 1/10 V Na Acetato 3 M + Vortex
[La aparición de un moco-ball ADN se observa en general]


Giran a 10 000 g durante20 minutos

Verter el etanol con precaución + Añadir 800 L de etanol al 70% a -20 ° C
No vórtice: la pastilla podría ser separado y perdió!


Giran a 10 000 g durante 12 minutos
Verter el etanol con precaución, vacío secar el pellet, si es posible con un calentamiento moderado
(Utilice un kleenex para eliminar las últimas gotas que quedan en los lados del tubo y un Speedvacsecar)


Resuspender el precipitado en 100 y 200 l H2O
(Deja que el ADN solubilizar a temperatura ambiente. Para acelerar el proceso, poner en un baño de agua a 37 ° C y cada 5 minutos...