extraccion de ADN

PROTOCOLO PARA EXTRACCION DE ADN
Bioseguridad: Considere las normas de seguridad tipo II para manipular los aislamientos y trabaje siguiendo las normas establecidas para el laboratorio en el manual general. El día anterior viabilice los aislamientos y prepare los reactivos como se indica a continuación:
Aislamientos
Mantenga los aislamientos en Skim Milk a -70ºC.
Incube las cepas enagitación constante durante toda la noche en 5 ml de caldo LB más 50ug/ml del antibiótico adecuado para la selección del plásmido.
PREPARACIÓN DE ADN
1. Centrifugue el cultivo a 5.100xG, 10min a 4ºC.
2. Descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200µl de TEG, conteniendo 2mg/ml de lisozima. Deje la suspensión 5min a TA.
3. Adicione 400ul de buffer de lisis, mezcle rápidamente por inversióncinco veces (no vortex).
4. Deje la suspensión en hielo durante 5min (Este tiempo es óptimo para la liberación del ADN, evitando la desnaturalización irreversible del ADN).
5. Adicione 300ul de acetato de sodio 3M (o acetato de potasio 5M) y mezclar por inversión. Deje 5min en hielo.
6. Centrifugue 10min a 15.355xG a 25ºC.
7. Recupere el sobrenadante, pase a un tubo nuevo y adicione 480ul deisopropanol (isopropilo alcohol, alcohol isopropílico o 2-propanol) frío.
8. Mezcle bien por inversión muchas veces. Deje 10min a 4ºC
9. Centrifugue 10min a 15.355xG a 4ºC. El ADN precipita como um pellet blanco.
10. Descarte el sobrenadante, seque a TA por 10min hasta que se evapore el alcohol.
11. Lave el ADN por adición de 1ml de etanol 100%. Mezcle por vortex y deje 5min a TA.
12.Centrifugue a 15.000xG por 5min a 4°C.
13. Descarte cuidadosamente el sobrenadante tanto como sea posible el sobrenadante y deje secar el pellet por 10min hasta que se evapore todo el alcohol.
14. Para resuspender el ADN en adicione 75µl de agua destilada o buffer TE 1X. Una muestra de 5µl es suficiente para ver claramente bandas en un gel de electroforesis.





INFORME DE LABORATORIO.



1.¿Qué son las endonucleasas?

Las endonucleasas son proteínas bacterianas, que dirigen o cortan en fragmentos la línea del ADN a partir de una secuencia que reconocen, las endonucleasas también denominadas enzimas de restricción, son las principales herramientas recombinante de ADN,    las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leenigual en ambas direcciones). Esta enzima reconoce una secuencia específica de nucleótidos, ya sea adenina, guanina, citosina o timina (AGCT), cortando el ADN en lugares donde se combinan los nucleótidos. Como estas son aisladas de bacteria designan nuevas secuencias.

Se extraen de organismos procarioticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genéticoextraño que entre mecanismo de defensa,  Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.  Las enzimas de restricción no pueden cortar ADN metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:

Tipo I y Tipo III:

a. Tienen actividad de restricción (cortan) ymodificación (metilan).

b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo.  Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.

c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.


Tipo II:a. Sólo tienen actividad de restricción.

b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.

c.  Sólo requieren Mg++ como cofactor.

d. No necesitan ATP.

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima.  
La...