Extraccion de rna y dna bacteriano

Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata

Bioquímica III- 2009
Trabajo Práctico Nro 4 Extracción de RNA y DNA bacteriano

INTRODUCCIÓN El RNA es el ácido nucleico más abundante en la célula, y puede purificarse fácilmente. Una célula típica contiene 10 veces más RNA que DNA. El azúcar presente en el RNA es la ribosa, que posee un grupo hidroxilo (OH) libre en laposición 2'. Este grupo participa en la formación de un intermediario en el mecanismo de hidrólisis y determina que el RNA sea químicamente inestable, y se hidrolice fácilmente en una solución acuosa alcalina. En la mayor parte de los casos, el RNA es un polímero monocatenario (ssRNA), pero las secuencias nucleotídicas de estas moléculas poseen, en mayor o menor medida, regiones complementarias quedeterminan tramos de apareamientos intracatenarios (estructura secundaria en forma de dsRNA). Las RNAsas utilizan el mismo mecanismo que se observa en la catálisis alcalina, pero la mayoría de estas enzimas atacan exclusiva- o preferentemente la ssRNA. Cuando se desea clonar un determinado gen para luego analizar su expresión resulta de mucha importancia la obtención de preparaciones de RNA limpias yque contengan moléculas intactas. El RNA proveniente de cualquier célula puede ser copiado a moléculas de DNA de doble hebra y estas luego pueden ser clonadas en un vector resultando en la producción de bibliotecas de cDNA específicas del tipo celular en cuestión. Para que estos clones sean útiles en el análisis resulta crítico que se cuente con RNAs íntegros y completos como material de partida. Lamayor dificultad para la obtención de dichas preparaciones es que la mayoría de las RNAsas, que degradan nuestras moléculas de interés, son enzimas muy estables y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequeña cantidad de las mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparación puede constituir un verdadero problema. Existen tres pasos fundamentales en laextracción de un ácido nucleico (DNA o RNA): 1) Homogeneización de la muestra: Permite la disgregación de la estructura tisular y celular para facilitar la salida de los ácidos nucleicos. Dentro de los métodos para la homogenización podemos mencionar los físicos como la sonicación, hervido, congelación-descongelación, choque osmótico, etc; los químicos como la utilización de detergentes (SDS) y también losenzimáticos como la lisozima, la proteinasa K, etc. El agregado de quelantes de magnesio, como el EDTA, a las soluciones de extracción contribuye también a la reducción de la integridad de las membranas. 2) Separación y Purificación: Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez mas limpio. Dentro de las metodologíasutilizadas las más comunes son la extracción con mezclas de fenol-cloroformo y la separación cromatográfica. En el caso del fenol-cloroformo, el primero se utiliza para la desnaturalización y solubilización de las proteínas y componentes celulares y el cloroformo permite la separación de las fases durante la centrifugación, además de también ser desnaturalizante. Cuando lo que se utiliza es unaseparación cromatográfica generalmente se recurre a columnas preempaquetadas ya sea de afinidad o de intercambio iónico previa unión del ácido nucleico a resinas o matrices de sílice. Estas son lavadas varias veces para eliminar contaminantes y posteriormente se procede a la elución del ácido nucleico. 3) Precipitación: Permite la obtención del ácido nucleico listo para ser almacenado o diluido ala concentración deseada para su utilización. Este paso se realiza mediante el agregado de 1 volumen de isopropanol o 2 a 3 volúmenes de etanol.

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Se pueden mencionar muchas metodologías para la extracción de DNA y RNA de las células en función del tipo de muestra (células procariotas o eucariotas, vegetales, animales, etc) y del grado de pureza que se quiera obtener condicionado por las...