extraccion mitocondrial por sedimentacion

3.1. Extracción de mitocondrias por sedimentación
3.1.1. Fundamento básico
La base experimental del aislamiento de mitocondrias es similar con independencia del tejido a analizar. En primer lugarse procede a la ruptura de la membrana celular manteniendo la estructura de las mitocondria integras. Seguidamente la fracción mitocondrial se aísla de otros orgánulos y restos celulares porcentrifugación diferencial.
3.1.2. Reactivos
Proceso de desionización de la solución de sacarosa
La solución de sacarosa (SIGMA S9378) 250 mM se trato con una resina de intercambio iónico (PANREAC 125436)durante toda la noche a 4ºC con agitación, después del tratamiento se pasó por filtro Milli-pore de 50 µm y se conservo en alícuotas a -20ºC.
Medio 1 (pH 7,4)
Sacarosa desionizada 250 mM
NaTes(pH 7,4) (SIGMA T1375) 5 mM
EDTA (Sigma ED2SC ) 1 mM
Agua milliQ
Medio 2 (pH 7,4)
Sacarosa desionizada 250 mM
NaTes (pH 7,4) (SIGMA T1375) 5 mM
BSA 99% (ALDRICH A02801 FFA)  5 mg/mlAgua milliQ

3.1.3. Material y equipos
Homogeneizador Potter Elvhejem (BRAUN)
Tubo de vidrio y pistilo para el homogeneizador
Centrifuga RC 28 S (Sorwall)
Rotor SS-34 (Sorwall)
Adaptadores pararotor SS-34 (Sorwall)
3.1.4. Procedimiento
Inmediatamente después de la extracción el hígado se introdujo en medio 1 (10 ml/g tejido) a 4ºC y se fragmentó con tijeras. A continuación se homogeneizóen un homogeneizador Potter Elvhejem (6/8 ciclos de 10 seg). El homogeneizado resultante se centrifugó a 3000 g durante 10 min a 4ºC (1), el sedimento constituido por núcleos y restos celulares sedesechó. Con el sobrenadante se realizó una centrifugación a 9000g durante 10 min a 4ºC (2), se desechó el sobrenadante. El nuevo sedimento está formado por mitocondrias pero pueden quedar restos deotros orgánulos. Para proceder a la purificación del sedimento mitocondrial fue resuspendido con pipeta en medio 2 (2/5 del volumen inicial) y se repitieron los pasos 1 y 2 obteniendo un precipitado...