Extracción de DNA cromosómico

TP 1: “Extracción de ADN cromosómico
de Escherichia coli”
Objetivos
El objetivo del trabajo práctico es la extracción de ADN cromosómico a partir de un pellet de bacterias de Esterichia coli (E.coli)
Esquema del procedimiento
Para la extracción de ADN cromosómico se siguieron los siguientes pasos generales:
Degradación del tejido: partimos de un pellet de bacterias ya cosechadas porcentrifugación, provenientes de 50 ml de cultivo de Escherichia coli (tipo salvaje), crecido en medio rico. Se tomó un inóculo de una colonia de una caja de Petri donde se sembraron las bacterias y se dejó crecer a 37° C en un medio líquido entre 12 y 16 horas. Dentro de este período no se llega a degradar el DNA.
Lisis celular: una vez que se tiene el inóculo de bacterias se las rompe intentandopreservar la estructura del ADN. En el laboratorio llevamos a cabo este paso. Cabe aclarar que el tipo de bacterias con el que trabajamos pertenece al conjunto de las gram negativas cuya característica principal es presencia de dos membranas lipídicas entra las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano.
Clarificación
Purificación
En esta experiencia no nos detendremos acuantificar el DNA obtenido.
A continuación desarrollaremos los pasos seguidos para realizar la lisis celular preservando la estructura del ADN.
Pasos del protocolo seguido
Función en el proceso de purificación del ADN
Recibimos un tubo con las bacterias E. coli resuspendidas en 2 ml de buffer Tris-HCl 50 mM (pH=8), sacarosa 25% p/v. Se mantuvo el cultivo a una temperatura de 0ºC
Tris-HCl: funcionacomo un tampón que mantiene el pH constante todo el tiempo (se puede notar más adelante que todas las soluciones están a pH=8). Es importante mantener este pH ya que el ADN está cargado negativamente, a un pH menor por ejemplo aumentaría la concentración de H+ neutralizando la carga negativa del ADN.
Sacarosa: regula la osmolaridad del medio. Evita la lisis celular por ósmosis.
Temperatura 0° C:a esta temperatura mantenemos inactivadas las enzimas propias de la bacteria por lo que el DNA a purificar corre menor riesgo de ser degradado.
Añadimos con una P1000, 0,8 ml de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,25 M, pH=8 y mezclamos 10 minutos suavemente con una varilla.
EDTA:
inactiva las DNasas. Estas enzimas trabajan en forma óptica en presencia del catión Mg+2.EDTA “secuestra”cationes Mg+2 impide la actividad enzimática de las mismas.
se sabe que la membrana externa de las bacterias Gram negativas está estabilizada por cationes Ca+. Con EDTA se secuestran estos cationes desestabilizando la membrana externa.
Agregamos con una P1000, 0,4 ml de lisozima (10 mg/ml). Revolvimos suavemente con la varilla y dejamos 10 minutos.
Lizozima: degrada la pared celular. Degradauniones covalentes del peptidoglicano. Esta enzima para poder trabajar necesita un pH cercano a 8, es por esto que también se quiere mantener constante el pH= 8. Muchas de las bacterias afectadas por lisozimas no son patogénicas. En algunos casos, la lisozima es la razón principal por la que estos organismos no llegan a ser patogénicos. La lisozima también altera la pared celular de bacteriaspatógenas transformándolas en esferoplastos o protoplastos, denominados formas L. La lisozima puede actuar como una opsonina innata o como una enzima catalítica. Las lisozimas sirven como opsoninas innatas uniéndose a la superficie bacteriana, reduciendo la carga negativa y facilitando la fagocitosis de las bacterias, todo esto antes de la llegada de las opsoninas del sistema inmunitario. En otraspalabras, la lisozima hace que las células fagocíticas puedan absorber más fácilmente a la bacteria. Como enzima funciona atacando a los peptidoglicanos, lo que explica su localización en la pared celular de las bacterias, especialmente en las gram positivas. La lisozima hidroliza el enlace glucosídico entre el carbono 1 (C1) del residuo de ácido N-acetilmurámico (NAM) y el carbono 4 (C4) de la...