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Boletín Oncológico

Aspectos básicos de la biología molecular (II)
Autor Miguel Ángel Dasi

- Introducción
- Las enzimas
- La clonación
- La electroforesis
- La hibridación
- Secuenciación de los ácidos nucleicos
- Técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos
- Bibliografía INTRODUCCIÓN
Pocas áreas de la Biología Molecular han permanecido inalteradas con la aparición de una serie de técnicasenglobadas
dentro del término genérico de Ingeniería Genética y referidas indistintamente como clonaje, DNA recombinante o
manipulación genética. Antes del desarrollo de la Ingeniería Genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en
cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto.
LAS ENZIMAS
Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintosprocesos de la Biología Molecular. Entre ellas
podemos destacar:
Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotídicos
del interior de la cadena. Las endonucleasas de restricción son enzimas producidas principalmente por bacterias que
hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto de DNA de doble hebra en secuencias específicas. Lasendonucleasas de
restricción de tipo II son las más útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto
para la reacción de unión como para la de ruptura.
Las enzimas de restricción se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las
dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia. El número señala el ordencronológico de
descubrimiento de esa enzima en esa estirpe.
Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría
impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de
palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario.
Lasendonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3´ o 5´ monocatenario, de unos cuatro
nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.
Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA “in vitro”. La mayoría de estas enzimas
requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayorfrecuencia son: DNA polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA
para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y
la Taq polimerasa (enzima empleada en la reacción en cadena de la polimerasa). La mayoría de las polimerasas
necesitan un pequeño cebador o primer complementario al DNA moldepara iniciar la polimerización a partir de ese
punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los
extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+.
Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), Fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5´
de los ácidos nucleicos, quinasas (incorporan fosfatosen el extremo 5´ que han dejado las fosfatasas) etc...
LA CLONACION
Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero
el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que
tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vezreplicado considerablemente se
recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un
gran número de copias del fragmento de interés. LA ELECTROFORESIS
Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación se realiza en un gel, que
es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de...