Fraccionamiento Subcelular

PRÀCTICA : FRACCIONAMENT SUBCEL.LULAR Objectius: Aprendre a organitzar el treball de laboratori en una pràctica de 5 sessions de durada: preparar i etiquetar el material necessari, distribuir el temps de realització de les tasques a realitzar, etc, amb l’ajut de les instruccions del guió. Treballar en grups de dues persones. Establir un sistema clar de recollida de resultats parcials que permetiarribar a l’obtenció dels resultats finals. És molt recomanable confeccionar la taula de recollida de resultats indicada. Presentar i discutir els resultats de forma entenedora

-

-

Aquesta pràctica inclou : - aprenentatge de les tècniques d’homogenització i centrifugació diferencial: mesura de l’activitat LDH, mesura de proteïnes totals. - treball dels conceptes: enzim (o molècula)marcador d’una fracció subcel·lular, puresa o nivell de contaminació d’una fracció obtinguda i activitat específica d’un enzim.

FRACCIONAMENT SUBCEL.LULAR Objectius: - Aïllar fraccions subcel·lulars del fetge de rata per centrifugació diferencial. - Avaluar les característiques d'aquest procés mitjançant l'ús d'un enzim marcador (lactat deshidrogenasa) de la fracció desitjada (citosòlica):recuperació obtinguda, distribució de l'activitat en les diferents fraccions (concepte de contaminació), grau de purificació. Introducció: Normalment, per estudiar la bioquímica d'una determinada fracció subcel·lular es parteix d'un determinat teixit (en aquest cas fetge de rata). Les cèl·lules es trenquen per homogenització del teixit en medi isotònic. L'homogenat constitueix la mostra que posteriormentse sotmetrà a diferents tècniques de separació en funció del material subcel·lular que interessi purificar. En aquest cas s'obtindran les següents fraccions subcel·lulars: nuclear, citosòlica, mitocondrial i microsomal, mitjançant la tècnica de centrifugació diferencial. Anàlisi de les fraccions subcel·lulars obtingudes: Per avaluar la reproducció que hem fet d'aquest protocol usarem dos eines: lamesura del contingut de proteïna total i la mesura de l'activitat lactat deshidrogenasa (LDH). El contingut de proteïna total és un paràmetre inespecífic que ens donarà informació sobre les pèrdues globals que puguem tenir al llarg de tot el procés. L'activitat enzimàtica LDH és específica del citosol cel.lular (enzim marcador), per tant, la presència d'aquesta activitat en cadascuna de lesfraccions on es mesura, serà indicatiu de la presència de citosol en cadascuna d'elles. Per tal d’evitar la degradació i alteració dels components cel·lulars, i en especial els enzims, durant el processat dels teixits, a la major part de tècniques bioquímiques sempre es treballa mantenint les mostres biològiques en fred ( aproximadament 0-4 ºC). Per tant cal que vigileu molt bé de mantenir sempre lesvostres mostres en gel. Procediment: Abans de començar, llegir tot el procediment i preparar tot el material: retolar i preparar tubs i recipients, el bany d'aigua a 0º C, (gel triturat). A temperatura ambient els orgànuls són degradats per enzims hidrolítics alliberats durant l'homogenització del teixit. És important minimitzar el temps de totes les operacions. 1. S'eixuga un fragment de fetgesobre un paper de filtre per tal de descartar la sang que pugui quedar a l'exterior de l'òrgan. 2. Es pesa aproximadament 1g de fetge sobre un vidre de rellotge fred (o paper d’alumini) i es fan fragments petits amb unes tisores o bé un cutter.

2

3. Es mesuren en una proveta 18 ml de medi d’homogenització. S'introdueixen els trossos de fetge dins el tub d'homogenització juntament amb un volumraonable (que no sobreïxi) del medi d’homogenització, uns 5ml. 4. Un cop homogenitzat el teixit amb el politró, s’afegeix la resta de tampó d’homogenització (18 ml en total). Remenar. 5. En un embut col·locat sobre una probeta, filtrar l'homogenat amb dues capes de gassa (neta), escórrer la gassa i enrasar a 20 ml. Repartir 2 ml de l´homogenat filtrat en 2 eppendorf (1ml/eppendorf) i guardar-los...