Genetica

HENRY SALAZAR Junio 19, 2007 Práctica 1-2 Extracción de ADN y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) – Diagnóstico de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y Herpes 1-2

Práctica 1-2: EXTRACCIÓN DE ADN Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) - Diagnóstico de Toxoplasma gondii, Citomegalovirus y Herpes 1-2 OBJETIVOS 1. Aprender la técnica de extracción de ADN humano a partir de sangreperiférica. 2. 3. ADN El ADNes una macromolécula compleja, compuesta por dos cadenas o hélices que se entrelazan entre sí formando una doble hélice. Cada cadena está formada por millones de eslabones, llamados nucleótidos o bases nitrogenadas (son cuatro: A-T, G-C). Ambas hélices están unidas entre sí, a nivel de los eslabones complementarios de cada hélice, por parejas. La secuencia de los pares debases es lo que determina el código genético. Según el orden que sigan esos pares de bases, se codifica una función u otra, o simplemente no se codifica nada. El ADN de la célula se organiza en cromosomas. Cada cromosoma es una molécula largísima de ADN. El ser humano tiene su DNA organizado en 23 pares de cromosomas distintos, es decir, 46 cromosomas. La mínima secuencia de ADN que es capaz decodificar una función o una estructura completa se denomina GEN. Sin embargo existen largas secuencias del ADN, que aunque molecularmente se compongan de lo mismo que un GEN (son una secuencia de nucleótidos), no codifican absolutamente, y por lo tanto no se les llama genes. Algunos han llamado a esas secuencias ‘vacías’, ADN basura. Hoy día se piensa que la función de ese ADN es estructural, esdecir, contribuye a dar estabilidad a la molécula de ADN. Cada cromosoma contiene miles de genes. Hoy día se estima que el ser humano tiene más de 30.000 genes en sus cromosomas. Usar el ADN extraído en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Conocer las aplicaciones de la PCR

INTRODUCCIÓN La PCR es una reacción bioquímica in vitro catalizada por una enzima, en la cual pequeñas cantidadesde un segmento específico de ADN, que se hallan entre dos regiones de ADN de secuencia conocida, son amplificadas obteniéndose una gran cantidad de ADN lineal de doble cadena. Debido a que la PCR está basada en la acción enzimática de una ADN polimerasa (la más comúnmente utilizada es la Taq ADN pol I que es una de las enzimas más extensamente caracterizada y aplicada en biología molecular), latecnología de la PCR fue aplicada inmediatamente en varias áreas de investigación, incluyendo la tecnología del ADN recombinante, la expresión génica, medicina general, medicina forense y evolución. Actualmente, la tecnología de la PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de las enzimas de restricción, con el clonaje del ADN y con el Southern blotting en el avance de la biologíamolecular. Los primeros experimentos de amplificación con PCR fueron realizados por el Dr. Mullís y el Dr. Fred A. Faloona, un matemático quien desarrolló el primer dispositivo automático regulador de la temperatura en ciclos, conocido como termociclador o máquina de PCR (Mullís y Faloona, 1987). La amplificación del ADN se obtiene por ciclos repetidos de PCR, cada uno de los cuales consta de tresestadios de temperatura distintos: (1) Desnaturalización del templado o "plantilla" de ADN (ADN que servirá de modelo para su amplificación) a una temperatura de 94 a 96ºC.
1)

Unión o annealing de los primers (conocidos también como cebadores). Los primers son olígonucleótidos, formados por moléculas de cadena simple de ADN que son complementarios a ambos extremos de una secuencia determinada deADN que actúa como templado o plantilla. Su función es servir al templado de ADN como punto de partida para la polimerización. Este paso requiere una temperatura que varía entre los 42 a 60°C; y 3) Extensión del primer por ADN polimerasa: Los primers son extendidos en una cadena templado de ADN de cadena simple (previamente desnaturalizado) gracias a la enzima ADN polimerasa en presencia de...