Gentica

03. TÉCNICAS DE ESTUDIO

electroforesis de proteínas

• Se basa en el hecho de que un solo aminoácido diferente en una proteína (resultado de una mutación en la correspondiente secuencia de DNA) puede causar una leve modificación en la carga eléctrica de la proteína.
• La ligera diferencia de carga hará que las forma normal y la mutada migren distinto a través del gel

CONS
•Las sustituciones silenciosas que no alteran los aminoácidos no se pueden detectar
• Algunas sustituciones de aminoácidos no modifican la carga eléctrica de la molécula proteica
• La sustitución de una única base en el DNA no codificante no suele detectarse mediante la electroforesis de proteínas

• Solo detecta alrededor de 1/3 de las mutaciones que se producen en el DNAcodificante

polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (rflp)

• Utiliza encimas bacterianas conocidas como endonucleasas de restricción o enzimas de restricción.
• Estas encimas restringen la entrada del DNA extraño en el interior de las bacterias, dirigiendo o cortando el DNA en secuencias específicamente reconocidas. Tales secuencias se denominan sitios de restricción ositios de reconocimiento
- Ej: EcoRI reconoce la secuancia GAATTC, cada vez que la encuentra corta entre la G y la A, produciendo fragmentos de restricción del DNA

Aplicación
• Si, por ejemplo, un individuo tiene la secuencia GATTT (en vez de GATTC), la enzima no cortará esta secuencia, pero sí cortará las normales que están localizados a ambos lados de la secuencia mutada
• Estefragmento específico será mayor en el individuo que carezca del sitio de restricción que en el que lo tenga.

Pasos para visualizar
1. Extracción de DNA
2. Digestión del DNA mediante una enzima de restricción (ej: EcoRI), proceso llamado “digestión de restricción”
3. Separación de fragmentos mediante electroforesis en gel (por tamaño, a diferencia de la de proteínas que es por carga).Los fragmentos pequeños migran más rápidamente.
4. Técnica de Southern: se transfieren los fragmentos desde el gel a una membrana sólida (como la nitrocelulosa) con el fin de fijarlos
5. Para encontrar fragmentos específicos se diseña una sonda empleando técnicas de DNA recombinante (hibridación). Sonda consiste en un pequeño fragmento de DNA humano monocatenario insertado en un vector (ej:un fago, un plásmido, etc). La sonda está marcada, con frecuencia con un isótopo radioactivo. La transferencia se expone a miles de copias de la sonda marcada que se aparearán a las bases complementarias con los fragmentos de DNA monocatenarios apropiados que se encuentren en la transferencia. La sonda identifica una porción específica de DNA, por lo general uno o dos fragmentos.
6. Paravisualizar la sonda hibridada, se expone a una película de rayos X, que se oscurece en la posición de la sonda (emite partículas radioactivas). Esto da una autorradiografía

CONS
• La clonación es laboriosa, requiere una semana o más de laboratorio
• La transmisión standard de Southern requiere cantidades grandes de DNA purificado (hasta 1 ml de sangre para obtener ese DNA)

southernblot

• Se utiliza para detectar una secuencia específica de DNA en segmentos más grandes que los que se usan para PCR (al menos 20-30 pb)
• Utiliza enzimas de restricción

Pasos
1. Restricción con endonucleasas
2. Correr en electroforesis en gel
3. Sobre el gel se coloca una membrana sólida de nitrocelulosa y se calienta para separar las cadenas de DNA en 2 simples
4. Seagrega la sonda. Si la secuencia a determinar está presenta, ésta se va a hibridar con la sonda.
5. Se lava la membrana para eliminar la sonda no apareada
6. Si existe radioactividad o fluorescencia es porque la secuencia está presente en los fragmentos de DNA

Aplicación en enfermedades
• Monogenética: PCR + sondas

amplificación del dna mediante la reacción en cadena de...