Gpn2

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PURIFICACION DE LA PROTEINA RECOMBINANTE HIS-GPN2 PARA LA GENERACIÓN DE UN ANTICUERPO POLICLONAL EN CONEJO

Hernández Meza J.M.; Sánchez Olea R.; Calera Medina M. R. Reyes Padrón H.

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SAN LUIS POTOSI; INSTITUTO DE FISICA

Resumen

La proteína GPN2 es un miembro de una familia pequeña de proteínas G que incluye, además, a la GPN1 y a la GPN3. Estas tres proteínascomparten un alto porcentaje de identidad en su secuencia de aminoácidos y se asocian físicamente entre sí, pero se desconoce cuál es su función a nivel molecular. La proteína GPN2 está muy conservada durante la evolución y se encuentra catalogada como esencial en diversos organismos, pero aún se ignoran aspectos tan básicos como son el patrón de expresión y la localización subcelular de estaproteína, los cuales sería factible realizar si existiera un anticuerpo específico. En el presente trabajo se aplicaron métodos básicos de ADN recombinante para producir y purificar la proteína His-GPN2 de origen humano en bacterias. La proteína His-GPN2 se localizó en cuerpos de inclusión bacterianos y se localizó, por lo tanto, en la fracción insoluble. La utilización de condiciones desnaturalizantes(cloruro de guanidinio 6M) permitió solubilizar y purificar exitosamente a la proteína His-GPN2. Esta proteína recombinante se dializó contra PBS y se cuantificó midiendo su absorbencia de la luz ultravioleta. Finalmente, la His-GPN2 se envió a la compañía americana Harlan para la elaboración de un anticuerpo policlonal en conejos. La disponibilidad de un anticuerpo efectivo y específico nospermitirá acelerar el estudio de la función molecular de la proteína GPN2 y establecer porqué es una proteína esencial para los seres vivos.

Introducción

La tecnología del DNA recombinante ha jugado un papel muy importante en el desarrollo de la Biotecnología de proteínas ya que a través de la manipulación de genes es posible producir grandes cantidades de proteínas, muchas de las cuales seencuentran en bajas concentraciones en su ambiente natural. Se considera una proteína recombinante o proteína heterologa aquella cuya síntesis se lleva a cabo en un organismo diferente al nativo.

Varios sistemas hospederos están disponibles incluyendo fagos, bacterias, levaduras, plantas, hongos filamentosos, insectos o mamíferos, todas ellas cultivadas en la cultura de los transgénicos.

Paraclonar un gen de interés en algún organismo hospedero se requiere de la selección apropiada de un vector. Un vector es cualquier vehículo utilizado para transferir un DNA extranjero a otra célula. Para clonar el gen de interés todos los vectores de ingeniería tienen una selección de sitios de restricción únicos inmediatamente después de una secuencia promotora de la transcripción.

Sin embargo, parala selección de un sistema hospedero adecuado, en la elección final del vector se debe tener en cuenta las necesidades específicas de la aplicación y, por supuesto, ser influenciado por el comportamiento de la proteína blanco. Un factor clave que ha conducido a un mayor uso de los vectores que dirigen la expresión de una proteína de fusión es que ésta contiene una etiqueta de tamaño conocido cuyafunción es la de facilitar el posterior aislamiento, purificación y detección de la proteína de interés. Las dos etiquetas más utilizados con este fin son el glutatión S-transferasa (GST etiqueta) y 6 residuos de histidina (His)6 tag. La selección de la tag (etiqueta) se hace de acuerdo a las necesidades específicas de aplicación.

La secuencia de ADN que especifica una cadena de seis a nueveresiduos de histidina se utiliza con frecuencia en vectores para la producción de proteínas recombinantes. El resultado es la expresión de una proteína recombinante con una etiqueta poli-His o 6His fusionadas a su extremo N-o C-terminal.

Las proteínas con una etiqueta de histidinas se pueden purificar y detectar con facilidad, ya que la cadena de residuos de histidina se une, en condiciones...
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