Guia Practica Pcr

Guía práctica sobre la técnica de PCR 517

Capítulo 17

Guía práctica sobre
la técnica de P CR
L aura Espinosa Asuar

PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en
Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas
veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede
trabajar a temperaturas muy elevadas, ya queproviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre
comercial más conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una reacción de
PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN y en
el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar –donde se encuentra elfragmento que queremos sintetizar– , los oligonucleótidos (llamados también
primers, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se inicie la
transcripción, dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima
trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en
forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo
de cadapolimerasa). Esta técnica tan ingeniosa tiene muchísimas aplicaciones
distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante en la biología
molecular; sus aplicaciones van desde la genética de poblaciones, evolución
molecular y genómica hasta la medicina forense.
¿Pero cómo funciona el PCR? Supongamos que ya tenemos los tubos listos
con todo lo necesario para que la síntesis del fragmento quenos interesa que
se lleve a cabo (taq polimerasa, dinucleótidos, ADN, agua, buffer con mag517

518 Las herramientas moleculares

nesio y otras sales, y oligonucleótidos). El siguiente paso es colocar los tubos
en una máquina conocida como termociclador, que básicamente sirve para
calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. ¿Cómo es que se amplifica el (o los) fragmento(s) quequeremos? Primero, para hacer más sencilla la
explicación, vamos a suponer que esperamos un solo fragmento de un tamaño
determinado, y lo que sucede es lo siguiente (ver el primer ciclo de la figura 1):
el termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que
se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción), la primera es
a 95ºC (y a este paso se lellama desnaturalización) durante la cual las dobles
cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas
sencillas; después el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40º y 60ºC (llamada de alineamiento), a esta temperatura se forman y se
rompen constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos
y el ADN, y aquellas uniones más estables (las queson complementarias)
durarán mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados” formando
una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño
pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al
agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases
estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio parael
siguiente paso. Después la temperatura sube a 72ºC (paso que se conoce como
extensión), ya que 72ºC es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su
máxima actividad, y continúa la síntesis de los fragmentos de ADN a partir
de los oligonucleótidos que ya se habían alineado.
En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizarán los primeros fragmentos a partir del ADNgenómico. Estos primeros fragmentos no
tendrán el tamaño esperado, serán un poco más grandes ya que la taq copiará
hasta donde le sea posible, pero como veremos más adelante, se obtendrán
en cantidades tan pequeñas que al final no podremos detectarlos. Después
se repiten una vez más las tres temperaturas, pero en este segundo ciclo, los
oligonucleótidos, además de unirse al ADN que pusimos al...