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Las enzimas son proteínas con un gran poder catalítico, tiene una gran especificidad por su sustrato (demostrado en el modelo llave cerradura postulado por Koshland y Neet) pero no afectan el equilibrio de la reacción La catálisis enzimática de las reacciones es esencial pata los sistemas vivos. En condiciones biológicas significativas, las reacciones sin catalizar tienden a ser lenta. (1)
Unareacción enzimática se de describe como:

E+S ES EP E+P

Donde E, S Y P son respectivamente, la enzima, el sustrato y el producto. ES y EP son los complejos enzima sustrato y enzima producto respectivamente. El complejo enzima sustrato es de importancia central en la acción de las enzimas y es el punto de partida para definir el comportamiento cinético de lasreacciones catalizadas por enzimas.(1)

Las condiciones del medio en el que actúa una enzima son de gran importancia para su actividad es por esto que factores como el pH y la temperatura pueden cambiar la capacidad catalítica de la enzima. La fosfatasa acida por ejemplo tiene un pH óptimo que fluctúa entre 4.7 y 5.5 ,esta participa en la hidrólisis de fosfatos monoésteres como un catalizadorsegún la siguiente reacción :

O fosfatasa ácida
R-O-P-O+H2O ROH+Pi
O

Es importante establecer que hay moléculas que son capaces de disminuir o bloquear la velocidad de una reacción enzimática, entre estas encontramos inhibidores enzimáticos, que sepueden unir específicamente a la enzima alterando grupos importantes para la función catalítica o modifican ligeramente la conformación de la proteína inactivándola sin llegar a desnaturalizarla.(2)
En este practico se utilizara un inhibidor fosfato, para este ensayo se hará el calculo de km y Vmáx para así poder determinar que tipo de inhibición que se lleva a cabo y su grafica respectiva .Objetivos

-Conocer algunos procedimientos para definir la actividad enzimática.
-Comprobar el efecto de inhibidores sobre la cinética enzimática.
-Determinar los parámetros cinéticos de la enzima utilizada.
-Observar la variación de la concentración de sustrato en el tiempo y determinar la constante de velocidad de la reacción catalizada y expresar gráficamente sus resultados-Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos en la interpretación de sus resultados.


Metodología y procedimientos

1-Elaboración de la curva de calibración del p-nitrofenol.

Se enumeraron 6 tubos de ensayo y se les agregó pNP 60uM y NaOH 0,05 M según la siguiente tabla:

1 2 3 4 5 6
pNP 60um (ml) 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
NaOH 0,05M(ml) 4,03,5 3,0 2,0 1,0 0,0

Luego se midió la absorbancia a 405nm en el espectrofotómetro, además se calculó la cantidad de pNP uM través de la siguiente formula:
Ej: 0,06 umol 1ml X= 0,03umol
X 0,5ml
Para luego proceder a graficar la curva obtenida y obtener los valores A y B para la ecuación de la recta que se usara en el ensayo 2.
Almismo tiempo se numeraron 10 tubos de ensayos a los cuales se les agregó 4,5 mL de NaOH 0,05M que se utilizarán en el segundo ensayo.

*Para calcular la ecuación dela recta se saco A y B para luego remplazar en la formula y poder sacar la Vo: y=mx+n
y=4,8712x+0,0106

2- Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa acida de germen detrigo y el efecto del fosfato en la reacción.

Se numeraron 10 tubos de ensayo, a cada tubo se agregó pNPP 2,5 uM, buffer citrato pH 5, a todos los tubos según las cantidades de la tabla, y fosfato 10mM, solo a los tubos 6-10, luego se incubó durante 5 minutos a 37°C para luego agregar la enzima de concentración 0,5 mg/mL. Se mezclaron por inversión y se volvieron incubar los 10 tubos por...