IBMC actividad alfa amilasa

TRABAJO PRÁCTICO 4
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA α-AMILASA



N° Grupo: 4
Turno: TP 4 Miércoles 14-18hs
Introducción:
Las enzimas son moléculas de naturaleza no necesariamente proteica que catalizan reacciones químicas. La actividad que catalizan las enzimas se realizan sobre moléculas llamadas sustratos, que dan como origen de la catálisis moléculas diferentes llamadas productos. Elestudio de la actividad enzimática se realiza observando el efecto que tiene dicha enzima sobre determinado sustrato, midiendo la desaparición del mismo o la aparición del producto esperado. Este mismo principio se usó para determinar la actividad de la enzima α-amilasa, además de su caracterización. El almidón está formado por amilosa y amilopectina- La α-amilasa es un enzima que rompe las unionesC1-C4 de dos glucosas, liberando como productos dextrinas lineales y ramificadas (Las dextrinas son oligosacáridos conformados por pocas unidades de glucosa) . Debido a que la actividad de la enzima se determinó usando un test colorimétrico que permite revelar la presencia de almidón en una solución, se midió la desaparición de sustrato por la desaparición de color en la solución. La caracterizaciónde la enzima α-amilasa se midió a partir de distintos tratamientos (en el tubo de reacción) y pre-tratamientos (anterior al tubo de reacción) realizados sobre la enzima, y su posterior actividad sobre el almidón midiendo el efecto logrado en cada caso.


Objetivos:

Determinar la actividad de la enzima α-amilasa obtenida de la saliva de un alumno.
Caracterizar la actividad de la enzimaα-amilasa cuando es sometida a distintos pre-tratamientos, y además entender el efecto que genera cada uno de ellos en la actividad de la misma.

Metodología:

La obtención de la enzima α-amilasa se logró recolectando saliva de un miembro del grupo en una vaso de precipitado. De la cantidad de saliva recolectada, se tomó 1ml y se la diluyó en 4ml de H2O (dilución 1/5) en un tubo de ensayo. Se mezclóla dilución obtenida con el fin de homogeneizarla. Con la dilución hecha, se determinó la actividad enzimática, como se mencionó en la introducción, a través de un test colorimétrico. El almidón fue teñido usando una solución de Lugol, que contiene 1% de I2 en equilibrio con ioduro de potasio (KI) 2% en agua destilada, obteniendo tri-ioduro que es mas soluble en agua que el I2. El tiempo en quese midió la desaparición de almidón producto de la actividad enzimática se tomó como tiempo de referencia, que debía darse en el intervalo de 3 a 8 minutos, también denominado Tiempo del Efecto Acromático, puesto a que es el tiempo en el que ya no se tiene la capacidad de distinguir entre dos rangos . Cada 30 segundos se sacaron alícuotas del tubo de reacción y se reportaron en tubos de 5 ml cadauno (conteniendo Lugol), llamados tubos de revelado, ya que el ellos se puede apreciar la variación de actividad por medio del color correspondiente de cada uno. Si la desaparición ocurre fuera de éste intervalo se usa una solución con saliva más concentrada o menos concentrada según sea el caso. La medición con esta dilución se encontraba fuera de este tiempo al estar muy concentrada, por lo cualrealizamos una nueva. Tomamos 2,5 ml de la solución anterior y le agregamos 2,5 ml de agua. El nuevo tiempo de referencia fue de 4 minutos, siendo el anterior de 1 minuto y medio. Este valor se usó como referencia al momento de realizar distintos pre-tratamientos y tratamientos para deducir como se ve afectada la actividad de la enzima bajo diversas condiciones.
Una vez obtenida la dilución, seprepararon varios tubos de ensayos conteniendo la solución de iodo, la cual era 250 ml de agua de canilla y 40 gotas de lugol, que teñirá el almidón de azul. Se prepararon 12 tubos, cada uno de ellos con 5 ml de la solución de lugol. Una vez preparados los tubos, se colocó el tubo de ensayo conteniendo los 10 ml de solución neutra (pH 7) de almidón 1%(m/v) entregado por los docentes en un baño...