Informe Ingeniería Genética Definitivo









Informe laboratorio Ingeniera Genética:
CLONACIÓN DE GEN HUMANO BCI.



Integrantes: Cristian Almiray R.
Gerardo De Lamotte Ávalos.
Profesor: Víctor Antonio García-Angulo
Fecha: 17 de Junio, 2015

Índice:

Introducción………………………………………………………………… Pág. 2
Desarrollo práctico………………………………………………………… Pág. 3
Diseño primers……………………………………………………………... Pág. 3
Amplificación del gen porPCR……………………………………………Pág. 4
Purificación producto PCR…………………………………………………Pág. 5
Ligación con vector pGEM-T easy………………………………………..Pág. 5
Electroporación………………………………………………………………Pág. 6
Screening……………………………………………………………………...Pág. 7
Extracción desde el vector…………………………………………………Pág. 7
Digestión………………………………………………………………………Pág. 8
Secuenciación………………………………………………………………..Pág. 9
Discusión……………………………………………………………………...Pág. 10Conclusión……………………………………………………………………Pág. 11













Introducción:

La clonación de un gen, mediante ingeniería genética, comprende un conjunto de métodos y técnicas que permiten manipular material genético de un organismo. Este paso consiste aislar una secuencia de ADN o ARN de una célula viva para producir múltiples copias de idénticas de este gen.
Esta propuesta se compone de múltiples etapas, en la que se destacan; aislamiento, extracción de muestra de materialgenético, digestión específica, inserción en un vector de clonación (en este caso pGEM-T easy) e incorporación en el organismo que actúa como receptor de este vector plasmidial.
A lo largo de este informe se detallarán todas las etapas cursadas para poder llegar al objetivo de clonar un gen en particular.



















Desarrollo práctico: Clonaje del gen humano BCI.

En primera instancia serecopilo toda la información necesaria sobre el gen que utilizaremos en el desarrollo del laboratorio, el cual se obtuvo de diversas fuentes, siendo las más precisa la entregada por el NCBI. En base a esto se conoció la secuencia nucleotidica y el peso molecular del gen, entre otras cosas.
BCI es un gen humano que posee un tamaño de 1989 pb. La proteína codificada por ese gen corresponde a unregulador negativo de la autofagia y el trafico endocitico. También se estima que tiene relación con la maduración del endosoma.
Nuestra estrategia de trabajo es la siguiente:

A partir de esta la estrategia planteada comenzamos el trabajo práctico.

I. Diseño de primers
Antes de empezar el diseño de un primer debemos saber cómo debe estar compuesto este. El primer debe tener una secuencia derestricción, en la cual una enzima determinada generar cortes en esta secuencia específica. También tiene que estar presente una secuencia de Kozak, la cual es una secuencia que facilita el reconocimiento de la secuencia de inicio durante el proceso de traducción en los eucariontes.
Se utilizaron sitios de corte de Not I y Age I cutas secuencias son gcggccgc (Not I) y accggt (Age I).
Por lo tanto el primerdiseñado seria el siguiente:
F: 5’ GCGGCCGCATGGTGTCACAATCTACAGTCAGG 3’
R: 5’ ACCGGTTGTTGCTGCAGAGGCCAC 3’

Una vez confeccionados los primer, es necesario calcular el porcentaje de G’s y C’s. También se calculan las temperaturas de Melting y Annealing, los cuales se representan en la siguiente tabla.

Forward
Reverse
%GC
57,1
55,5
Tm °C
64,1
63,94
An °C
59,1
58,94

II. PCR.
Se prepararon tubos conun preparado de Master Mix para realizar el PCR.

Muestra
Concentración
Buffer 10x
5µl
------
DNTP's (4mM)
2,5µl
0,2mM
Primer 1 (10mM)
2,5µl
0,1-1mM
Primer 2 (10mM)
2,5µl
0,1-1mM
DNA
1µl
-------
Dream Tag (5µ/mq)
0,25µl
1,25 u
H20
36,25µl
-------

Se realizó un PCR de 30 ciclos con temperaturas de 94°C (Denaturacion), 52°C (Annealing) y 72°C (Elongación). Una vez terminada la PCR se realizó unaelectroforesis en gel de Agarosa.

III. Purificación de producto de PCR

La purificación del producto del PCR se realizó mediante el kit “Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System”,el cual consistió en la purificaciones producto de PCR por medio de unión a columna.
Realizada la purificación del producto de PCR, se procedió a...