Ingeniera biologica

Protocolos laboratorios ingeniería genética

Primera práctica
Extracción ADN de plantas

Equipos, materiales y reactivos:
* Material vegetal
* Sacabocado o bisturí
* Pinzas
*Centrífuga refrigerada
* Neveras (40C, -200C)
* Baño María (650C)
* Medidor de pH
* Micro pipetas y puntas
* Agua destilada
* Tubos eppendorf
* Nitrógeno líquido
* Buffer2X CTAB
* CTAB 10 %
* Buffer TE
* Cloroformo
* Alcohol isoamílico
* Isopropanol
* Etanol
* -Mercaptoetanol

Procedimiento:
* Pesar 100-500 mg de tejido foliar,moler el tejido en morteros preenfriados con nitrógeno liquido hasta obtener un polvo fino.
* Transferir el polvo a un tubo eppendorf. Agregar 700 l e tampón CTAB y 2 l de -Mercaptoetanol, mezclarbien. Incubar las muestras en baño Maria a 65ºC por 45 min. Agitar suavemente las muestras cada 15 min. Dejar las muestras a temperatura ambiente por 2 min.
* Agregar 700 l de cloroformo /alcoholisoamílico (24:1) a cada tubo. Mezclar suavemente por inmersión para evitar dañar el ADN.
* Centrifugar las muestras durante 5 min. a 14000 rpm. Transferir el sobrenadante (ADN) a un tubo eppendorfnuevo. Tener cuidado de no absorber la interfase. Descartar el cloroformo /alcohol isoamílico remanente en contenedores debidamente etiquetados.
* Agregar 50 l de tampón CTAB al 10 % (en NaCl 0.7M), agitar suavemente hasta obtener una muestra uniforme
* Repetir los pasos 3 y 4.
* Agregar un volumen de isopropanol frío a cada tubo. Invertir los tubos varias veces y dejarlos enrefrigeración a 4 ºC por 30 min, o 15 min a -20ºC.
* Centrifugar las muestras a 14.000 rpm. Durante 20 min. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante para no perder nada de ADN. Dejar que el precipitadoseque invirtiendo los tubos abiertos por unos 2 min.
* Lavar el precipitado de ADN en 0.5 ml de etanol al 70 % centrifugar a 12.000 rpm. durante 10 min. Eliminar el etanol. Agregar 0.5 ml de...