Inhibición De La Actividad Enzimática En Procesos De Transformación

INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN PROCESOS DE TRANSFORMACIÓN




INTRODUCCION
En esta práctica lo que se busca hacer es observar la reacción enzimática a través de varias modificaciones de temperatura, pH, la concentración del sustrato y de la enzima, el tiempo. También se extrajo la fosfatasa ácida con la cual se realizo la curva de calibración par poder leer los datos dadosen el espectrofotómetro. La fosfatasa acida cataliza la hidrólisis del enlace ester fosfórico entre el grupo fosforilo y un grupo orgánico a pH acido liberando el fosfato.

MARCO TEORICO
Cinetica enzimática 2

Estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una enzima permite explicar los detallesde su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidadde reacción observada es la velocidad máxima (Vmax)

2 http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica
3 Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la que se muestra a continuación.Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

Grafica 1 : Grafica y ecuación de Michaelis –MentenFosfatasa acida 4

Fosfatasa ácida (orto-fosfórico mono metacrilato fosfohidrolasa) una enzima que cataliza la hidrólisis de un gran número de compuestos mono metacrilato fosfórico. Fosfatasa ácida está ampliamente distribuida en la naturaleza, y ha sido estudiada en varias plantas y animales.
Las fosfatasas ácidas se localizan fundamentalmente en los lisosomas, mientras que la localizaciónsubcelular de las fosfatasas alcalinas no está clara.
Para la demostración histoquímica de ambos grupos de fosfatasas, se utiliza como sustrato el naftol-AS-BI-fosfato al pH correspondiente. A continuación, el naftol liberado se demuestra con una sal de diazonio (Fast Red TR para la fosfatasa alcalina y pararrosanilina con nitrito sódico para la fosfatasa ácida). Tras la reacción, los núcleos secontrastan con hematoxilina. En el caso de la fosfatasa ácida, los cortes se deshidratan, se aclaran y se montan con Entellán o DPX. Sin embargo, en el caso de la fosfatasa alcalina no es posible la deshidratación, por lo que las preparaciones se montan con glicerina – gelatina.
DATOS OBTENIDOS
TABLA 0. CURVA DE CALIBRACION


TABLA 1.1 EFECTOS DE LA TEMPERATURA (practica 1)
TuboTemperatura, °C Absorbancia, 660 nm Abs. corregida Concentración de fósforo, µg/µL Velocidad de reacción, mM P/min
(Abs – BS – BE ) [P] mM de P
BB 18
BS 18 0,043
BE 18 0,23
1 0 0,31 0,037 0,000310139 0,015506958 0,001550696
2 18 0,242 0 1,59046E-05 0,000795229 7,95229E-05
3 37 0,434 0,161 0,001296223 0,064811133 0,006481113
4 60 0,508 0,235 0,001884692 0,0942345920,009423459
5 90 0,546 0,273 0,002186879 0,109343936 0,010934394


Grafica 1.1 efecto de la temperatura

TABLA 2.2 Efecto del pH (practica 2)

Tubo pH Absorbancia, 660 nm Abs. corregida Concentración de fósforo µg/µl Velocidad de reacción, mM P/min
(Abs – BS – BE ) [P] mM de P
BB 5,3
BS 5,3 0,036
BE 5,3 0,188
1 3 0,233 0,009 8,74751E-05 4,37376E-05...