Investigaci NBases

Un organismo semi - sintético con un alfabeto genético ampliado


Los organismos se definen por la información codificada en sus genomas, y puesto que el origen de la vida de esta información se ha codificado utilizando un alfabeto genético de dos pares de bases (A-T y G-C). In vitro, el alfabeto se ha ampliado para incluir varios pares de bases no naturales (UBPS) 1, 2, 3. Hemos desarrolladouna clase de UBPS formados entre los nucleótidos que llevan nucleobases hidrofóbicas, ejemplificada por la pareja formada entre d5SICS y DNAM (d5SICS-DNAM ), que es eficiente PCR-amplified1 y transcribed4, 5 in vitro, y cuyo mecanismo de replicación único ha sido characterized6, 7. Sin embargo, la expansión del alfabeto genético de un organismo presenta retos nuevos y sin precedentes: lostrifosfatos de nucleósidos no naturales deben estar disponibles dentro de la célula; polimerasas endógenas deben ser capaces de utilizar los trifosfatos no naturales para replicar fielmente ADN que contiene la UBP dentro del complejo medio celular; y finalmente, el UBP debe ser estable en la presencia de vías que mantienen la integridad del ADN. Aquí mostramos que una expresa exógenamente nucleótidostrifosfato de algas transportador importa de manera eficiente los trifosfatos de ambos d5SICS y DNAM (d5SICSTP y dNaMTP) en Escherichia coli, y que la maquinaria de replicación endógeno utiliza ellos para replicar con precisión un plásmido que contiene d5SICS-DNAM. Ni la presencia de los trifosfatos no naturales ni la replicación del UBP introduce una carga de crecimiento notable. Por último, nosencontramos con que la UBP no se escinde de manera eficiente por las vías de reparación del ADN. Por lo tanto, la bacteria resultante es el primer organismo para propagar de manera estable un alfabeto genético expandido.
Para hacer que los trifosfatos no naturales disponibles dentro de la célula, hemos sugerido previamente el uso de la difusión pasiva de los nucleósidos libres en el citoplasma seguidode su conversión al trifosfato correspondiente a través de la pathway8 salvamento nucleósido. Si bien hemos demostrado que los análogos de d5SICS y DNAM son fosforilados por la quinasa de nucleósido a partir D. melanogaster8,


monofosfato quinasas son más specific9, y en E. coli que encontraron la sobre-expresión de los
resultados difosfato quinasa nucleósidos endógenos en un crecimiento pobre.Como
alternativa, nos centramos en los transportadores de nucleótidos trifosfato (tractores de vía estrecha) de bacterias intracelulares obligados y plastids10-14 algas. Expresamos ocho tractores de vía estrecha en diferentes E. coliC41 (DE3) 15-17 y midió la captación de [α-32P] -dATP como un sustituto de los trifosfatos no naturales (. Extended Data figura 1). Se confirmó que [α-32P] -dATP setransporta de manera eficiente en las células por la tractores de vía estrecha de Phaeodactylum tricornutum (PtNTT2) 18 pseudonana andThalassiosira (TpNTT2) 18. Mientras tractores de vía estrecha de Protochlamydia Amoebophila (PamNTT2 y PamNTT5) 15 también importan [α-32P] dATP, PtNTT2 mostró la mayor actividad, y tanto ella como TpNTT2 se sabe que tienen amplia specificity18, haciéndolos lostractores de vía estrecha más prometedoras para la caracterización adicional. Transporte a través de un NTT requiere que los trifosfatos no naturales son suficientemente estables en medios de cultivo; Sin embargo, la caracterización preliminar de d5SICSTP y dNaMTP indicó que la descomposición se produce en la presencia de E. coli en crecimiento activo (Extended. Fig Data 2). Un comportamiento similarse observó con [α-32P] dATP, y los productos de desfosforilación detectados por cromatografía de capa fina para [α-32P] dATP o por HPLC y MALDI para d5SICSTP y dNaMTP, sugieren que la descomposición está mediada por fosfatasas. Como no se observó degradación tras la incubación en medio gastado, la descomposición parece ocurrir dentro del periplasma. No se observó aumento de la estabilidad en los...