investigacion en proteinas


Bioquímica
Curso 2010-2011




SEMINARIO DE INVESTIGACIÓN EN PROTEÍNAS





Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular
Facultad de Química
Universidad de Sevilla





Métodos de rotura celular y extracción de proteínas
La preparación de un extracto crudo depende del material biológico de partida:
-Para proteínas extracelulares de origen microbiano basta unasimple centrifugación. A veces la proteína no se libera al medio de cultivo sino que queda localizada en la parte externa de la membrana celular, por lo que hay que proceder a una destrucción parcial o total de la célula.
-Para proteínas intracelulares (microorganismos, plantas, animales) hay que proceder a la rotura celular. Los tejidos vegetales presentan la dificultad añadida de la paredcelular y los compuestos fenólicos.
El pH, la fuerza iónica y la composición del medio (cofactores) que se utiliza para la extracción de una proteína es de gran importancia para este proceso y en las siguientes etapas de purificación. Es importantísimo minimizar la pérdida de actividad por temperatura.

Métodos de separación de proteínas basados en diferencias de solubilidad y tamaño
Los métodosde separación basados en la solubilidad son:
-Precipitación al punto isoeléctrico (pI)
-Precipitación con sulfato amónico (salting out)
-Precipitación con disolventes orgánicos
-Precipitación por temperatura
Los métodos de separación basados en el tamaño son:
-Diálisis
-Ultrafiltración
-Filtración en gel (radio de Stokes , Kav = )
-Ultracentrifugación [coeficiente desedimentación s = v/2r, 1S (Svedberg) = 10-13 s]

Métodos de separación de proteínas basados en la carga eléctrica
Los métodos de separación basados en la carga eléctrica son:
-Cromatografía de intercambio iónico (separación por gradiente de pH o de fuerza iónica para separar)
-Electroforesis (movilidad electroforética  = v/E )

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) tiene en cuenta lacarga y el tamaño ( = VZ/f). Si se realiza en presencia de SDS da cuenta de las subunidades de las proteínas. El enfoque isoeléctrico permite separar las proteínas en base a su pI, gracias a que se establece un gradiente de pH a través del gel por adición de los anfolitos adecuados. La electroforesis bidimensional, que es la combinación secuencial del enfoque isoeléctrico y del PAGE-SDS, permitela resolución de mezclas complejas de proteínas.

Separación por adsorción y afinidad
La cromatografía en columna permite separar proteínas en base a su nivel de adsorción a una fase estacionaria hidrofóbica (carbón) o polar (sílice, alúmina, hidroxiapatito). Un refinamiento de estos métodos cromatográficos es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En la cromatografía de afinidadlas proteínas se separan en función de su especificidad de unión por un determinado ligando (enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo).

Criterios de pureza
La purificación completa de una proteína y su separación de todas las restantes puede determinarse mediante análisis electroforético, con lo que se establece la homogeneidad electroforética de la preparación: una sola banda de proteína en PAGE,dos bandas en PAGE-SDS para una proteína dimérica (αβ), etc. La banda de proteína puede visualizarse por tinción con azul de Coomassie, o por tinción de la actividad. Si se disponen de los anticuerpos (Ab) correspondientes a nuestra proteína que actúa como antígeno (Ag), se tienen las técnicas complementarias inmunoquímicas: inmunoelectroforesis y Western Blot (inmunoblot). Esta última técnica esmuy útil si se disponen de los anticuerpos específicos para nuestra proteína, que a su vez pueden detectarse mediante determinados sistemas reveladores (anticuerpos secundarios marcados radiactivamente o ligados a enzimas con sustratos cromogénicos, biotina-avidina).

Determinación de parámetros fisicoquímicos
Peso molecular (PM o Mr)
-A partir de la composición de aminoácidos: Mr = ( Mr...