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La clonación, la secuenciación y expresión heteróloga del gen para lupanine hidroxilasa, una quinocytochrome c de una Pseudomonas sp.
David J. TOLVA * 1, * Mustak A. KADERBHAI, Shirley A. MARRIOTT *, * JOVEN Michael y Jerzy ROGOZINSKI † * Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Gales,Aberystwyth, Ceredigion SY23 3DD, Reino Unido, y † Departamento de Bioquímica, Instituto de Biología de Plantas, la Academia de Agricultura, ul. Rakowiecka 26/30, 02-528 Warsaw, Polonia El gen que codifica la enzima hidroxilasa lupanine fue aislado por PCR utilizando ADN cromosómico de una lupanine-utilizando Pseudomonas sp. Como plantilla y primers basado en las secuencias de la N-y C-termini dela proteína purificada. Los derivados de la secuencia de genes producto maduro dio una proteína con una r de H 72256, en buen acuerdo con el valor encontrado por SDS / PAGE de la enzima puro, y contenía varias de las secuencias de péptidos obtenidos después de endoproteinase Lys-C de la digestión Puro enzima. El gen, en el marco del control transcripcional de un promotor phoA y con la Escherichiacoli secuencia señal de la fosfatasa alcalina, se expresó en E. Coli que contiene un plásmido de expresión de los genes de las proteínas citocromo c maduración constitutivamente. Haem que contienen proteína inactiva en cuerpos de inclusión renatured y fue reactivado con pyrroloquinoline quinona (PQQ) y Ca 2 + para dar enzima activa. El lupanine hidroxilasa (luh) gen codifica para una proteína conuna cleavable 26-residuo de la señal en su secuencia N-terminal, requeridos para el transporte de la enzima periplasmic a su ubicación. El análisis de la secuencia de la proteína mostraba que contiene dos dominios, una gran PQQ vinculante dominio N-terminal y una menor citocromo c dominio C-terminal. Comparación de los derivados secuencia con las de otras proteínas mostraron una considerablesimilitud con otros quino (hemo) proteínas, incluido el alcohol deshidrogenasas de una variedad de bacterias. La PQQ vinculante dominio secuencia contiene W motivos, característica de los ocho aspas de la hélice de la estructura de metanol deshidrogenasa, pero carece de la inusual estructura de anillo disulfuro formado a partir de dos adyacentes cysteines visto en esta enzima. El C-terminal compartealguna similitud con bacterias citocromo c, e incluye la haem vinculante CXXCH secuencia consenso. Palabras clave: citocromo c, pyrroloquinoline quinona (PQQ), quinohaemoprotein, renaturation, señal de secuencia. Abreviaturas utilizadas: lys-C, endoproteinase Lys-C; PQQ, pyrroloquinoline quinona.
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