Laboratorio 5 6

Materiales y Métodos
Materiales:
Solución buffer citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 pH 5.0
Sustrato p-nitrofenil fosfato de sodio 2.5 mM.
Solución p-nitrofenol 60 μM en NaOH 0.02 M.
Solución de 0.02M NaOH.
Solución de 0.1 M NaOH.
Agua destilada.
Solución stock de enzima 5 mg/mL en BSA 0.1% diluida 1:20.
Baño termoregulado a 37 ºC
Espectrofotómetro.

Curva de calibración para la formación dep-nitrofenol
Se realizó la curva de calibración para el producto de la acción de la enzima fosfatasa ácida. En 5 tubos de ensayos, con su respectivo blanco; se colocaron el producto p-nitrofenol, adiferentes concentraciones en presencia de NaOH 0.02 M como se muestra (Tabla 1a). Se midió posteriormente a 405 nm cada uno de ellos, para obtener su absorbancia. Se recopiló e hicieron los cálculos paradeterminar la concentración (Tabla 1b). Para finalmente realizar un gráfico de Concentración vs. Absorbancia. (Grafico 1).
Búsqueda del rango
Se preparó un tubo contenido 2 mL del sustrato, con 2 mLdel buffer citrato-EDTA pH 5, y se lo incubó por 10 minutos a 37 ºC. Seguido a esto, se agregó 1 mL de la enzima fosfatasa ácida de la enzima stock 5 mg/mL, y se sacaron alicuolas de 0.5 mL a diferentescantidades de tiempo, para finalmente para detener la reacción, se colocaron a 5.5 mL de NaOH 0.1M, según tabla (Tabla 2). Se midieron los resultados a 405 nm, y con la ecuación de la recta de lacurva de calibración previamente realizada, (y = 166,34x + 0,0211) se obtuvieron las concentraciones de producto formado. (Tabla 2). Se realizó el gráfico correspondiente de la aparición del productorespecto al tiempo (Gráfico 2).
Determinación de parámetros cinéticos
Se preparó en 5 tubos de ensayo, con su respectivo blanco; diferentes cantidades de sustrato, p-nitrofenil fosfato 2.5 mM, con buffercitrato-EDTA pH 5, se aforó a 4.5 mL con agua destilada y se incubó a 37 ºC durante 5 minutos (Tabla 3a). Seguido a esto, se adicionó 0.5 mL de enzima a cada tubo y se incubó durante 15 minutos....