Laboratorio de biotecnologia conteo de biomasa

DETERMINACION DE LA BIOMASA

I. INTRODUCCION
En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el número de microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento, análisis de alimentos, preparaciones de inóculos para fermentación, etc. (Aquiahuati, 2004).
Un parámetro clave en el modelado y monitoreo delfuncionamiento de plantas de tratamiento de efluentes líquidos es la concentración de biomasa. Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la concentración de biomasa, como por ejemplo masa, volumen, extensión linear de filamentos, dispersión de luz, conteo de células u organelas.
Existen diferentes métodos para cuantificarel número de microorganismos o peso (biomasa) de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer (Aquiahuati, 2004).
La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos ylevaduras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración, lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación. El método de cuenta directa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y económico, aunque no se pueden distinguir las células viables y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una muentra a partir delvolumen de la cámara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la observación y cuantificación de dificultan en células muy pequeñas (1 – 5 µm) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de muestra que se utiliza (0.1 – 0.2 mm3) (Aquiahuati, 2004).


II. OBJETIVOS
* Dominar el uso y lectura en la Cámara de Neubauer pormétodo de conteo directo.
* Conocer las técnicas para aplicar las fórmulas de conteo.
* Determinar la concentración de microorganismos (levaduras) a través del microscopio, utilizando la cámara de Neubauer.
III. FUNDAMENTO TEORICO
Cámara de Neubauer
La Cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en cultivo celular para realizar conteo de células en un medio de cultivo líquido.Consta de dos placas de vidrio, entre las cuales se puede alojar un volumen conocido de líquido. Una de las placas posee una grilla de dimensiones conocidas y que es visible al microscopio óptico.
Para contar las células de un cultivo líquido, se agrega una gota de este entre estas dos placas y observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un campo determinado de la grilla.Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo de la grilla, se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la solución de medio de cultivo inicial.

Figura 1. Cámara de Neubauer.


La imagen simula el campo que está viendo al microscopio con un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de la grilla. Intenta verificaresto al ir moviendo el campo de derecha-izquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Muy importante: Cuando la muestra observada se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas inferior y/o de la derecha.

Figura 2. Forma de manipulación de la cámara de Neubauer.La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área...