leganz2014




Cromatografía de interacción hidrofóbica

Este tipo de cromatografía se desarrolla al comprobarse que las proteínas se retienen,de forma inesperada, sobre geles de afinidad con cadenas espaciadorashidrocarbonadas. Empleando este concepto, se desarrollaron familias completas deabsorbentes empleando una serie de cadenas homologas entreC2 y C1068
,aunque enla practica la mayoría de lasproteínas pueden purificarse con agarosa acoplada congrupos fenilo y optilo.Las interacciones hidrofobicas son más fuertes a fuerza iónica alta, con lo que, amenudo, la absorción puede ser llevada a cabo tras la precipitación salina o lacromatografía de intercambio iónico, sin necesidad de modificar la concentraciónsalina de la muestra. Las proteínas ligadas sepuede eluir alterando el pH delsolvente, la fuerza iónica o mediante el empleo de un agente caotropico o unmodificador orgánico tal como el etilenglicol.
Los iones utilizados se pueden agrupar en series dependiendo de si promueveninteracciones hidrofobicas (efecto de eliminación de sales) o si se rompe la estructuradel agua (efecto caotropico) para debilitar la fuerza de interacción hidrofobica.

IONES QUE AUMENTAN EFECTO DE ELIMINACIONDE SALES
Aniones
PO4–>SO4–>CH3COO–>CL–>Br–>NO3–>ClO4–>I>SCN–

IONES QUE INCREMENTAN EL EFECTO CAOTROPICO
Cationes
NH4+>Rb+>K>Na+>Cs+>Li+>Mg>Ca2+>Ba2+


Se ha utilizado la cromatografía sobre columnas de fenil – sefarosa para purificar unaarilacilamidasa de pseudomonas fluorescens. La enzima se éluyo de una columna deintercambio iónico en tampón fosfato 0,3 M, pH 7,6 a partir de 2 Kg debacteria, y sepurifico mediante una columna de 500 ml de fenil – sefarosa en el mismo tampón y elempleo de un gradiente decreciente de 0,1M a o,01 M tris – HCL, pH 7,6




Modelos basados en la hidrofobicidad de las proteínas
Chen et al. (2008), propusieron modelos de tipo QSPR (relación de propiedades estructurales cuantitativas) para predecir el tiempo de retención de proteínas en HIC, tantoen elución isocrática como en gradiente. Este modelo se basa en descriptores moleculares que reflejan grupos de propiedades fisicoquímicas y estructurales de las proteínas, entre las cuales se encuentra la hidrofobicidad.
Por otra parte, se han desarrollado modelos empíricos de la forma mostrada en la ecuación (1), donde Fsurfacecorresponde a la hidrofobicidad superficial promedio de laproteína, DRT es el tiempo de retención adimensional, que corresponde al máximo del pico de elución normalizado por la duración del gradiente, y A, B y C son los parámetros del modelo (Lienqueo et al., 2002).
DRT = A + B Fsurface  + C Fsurface2                                                                                                         (1)
Los parámetros de este modelo no tienen significadofísico, y dependen de las condiciones de operación del sistema. Por lo tanto, se trata de un modelo empírico que sólo puede ser utilizado si se cumplen las siguientes condiciones: (1) las corridas cromatográficas se realizan en las mismas condiciones de operación empleadas en la generación del modelo; y (2) se conoce la estructura tridimensional de la proteína de interés, lo que permite determinar suFsurface. Si bien este modelo ha sido utilizado con éxito en el diseño racional de procesos biotecnológicos (Lienqueo et al., 2003), su aplicación se ve limitada debido a su restringida generalidad.
Cromatografía de fase reversa.

Se basa en las propiedades hidrofóbicas de las proteínas.
El proceso de elución es diferente que en la cromatografía hidrofóbica
La fase móvil es un solventeorgánico (metanol, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, ácido fosfórico, acético o hidroxibutírico).
Fase estacionaria

Sílica acoplada con un derivado alquilsilano.
La longitud de la cadena alquilo puede ser de C4, C8, C18.
La porosidad del soporte es variable y se recomienda que sea entre 300 a 1000 A
El tamaño de las partículas es de 5 a 20 μm

Fase móvil

La acidez de la...