Limulus Test - Ensayo de LAL

LAL TEST- GEL CLOT METHOD

Instrucciones para el uso del Reactivo de Limulus Test

Estamos adjuntando un archivo con las instrucciones para LAL Test en español y a continuación hacemos algunas notas aclaratorias:

 Lo primero que debe hacerse es guardar el vial de Reactivo Pyrotell y vial del Control Standard de Endotoxina (CSE) en heladera.

 En el momento de empezar a trabajar,retirar el vial del Estándar de Endotoxina de la heladera mientras el vial del reactivo deberá permanecer en la heladera hasta último momento.

 Reconstituir el vial del CSE con 5,0 mL de Agua para Test de LAL usando tips apirógenos o pipeta apirógena Se aconseja verificar este volumen con el certificado de potencia del Standard de Endotoxina ya que los certificados actualmente se emiten condiferentes volúmenes de reconstitución. (El Agua para test de LAL y los tips apirógenos para LAL de Associates of Cape Cod garantizan menos de 0,001 UE/ml por estar analizados con el Método cinético turbidimétrico de Associates of Cape Cod USA).

 Agitar el Standard de Endotoxina (CSE) en vortex durante 1 minuto dejando descansar 5 minutos. Y repetir la agitación de 1 minuto y el descanso en lamesada durante 5 minutos, durante un período de 30 a 60 minutos. (Ver Instrucciones del CSE de Associates of Cape Cod USA en Inglés)

 Mientras se cumple este periodo de agitación se pueden ir rotulando los tubos de dilución apirógenos (de poliestireno o vidrio borosilicato) para realizar las diluciones de la Curva del CSE y se puede comenzar a introducir el Agua para Test de LAL (LAL ReagentWater ó LRW) en estos tubos según el esquema de diluciones del CSE. Para hacer una curva del CSE rotular los tubos necesarios para hacer una curva hasta una concentración de ¼ de lambda (donde lambda es la sensibilidad del Reactivo) porque la curva que vamos a correr es para comprobar la sensibilidad del Reactivo., entonces deben correrse concentraciones que enmarquen la sensibilidad del reactivo(llamada lambda: λ ). Según se indica en la USP-Bacterial Endotoxins se deben correr 4 concentraciones de Endotoxina Standard: 2λ; λ; 1/2 λ y1/4 λ (Confirmation of Labeled Reagent Sensitiviy)por cuadruplicado cada vez que se cambia el lote de Reactivo o de Endotoxina.

 Aclaramos que no es necesario que el analista calcule la sensibilidad del Reactivo porque ya está declarada en la etiqueta delReactivo pero la USP dice que debe “confirmarse la sensibilidad” cada vez que se usa un nuevo lote de Reactivo o Endotoxina. (Ver USP- BacteriaL Endotoxins-Gel Clot Techniques-Preparatory Test-Test for Confirmation of Labeled Reagent Sensitivity)

 Si el usuario ha comprado un un Reactivo de Sensibilidad 0125 UE/mL, deberá hacer diluciones del CSE hasta ¼ de 0,125 UE/mL (esto es, hasta 0,03125UE/mL). Pedir el gráfico de Diluciones del Estándar de Endotoxina.

 La USP no establece que diluciones hacer, o sea que se pueden correrse las diluciones sugeridas por nuestra empresa o hacer otras diluciones pero siempre hay que llegar a tener 4 concentraciones finales que se van a usar para correr la reacción: 2 λ; λ; ½ λ y ¼ λ.

 Luego de realizar la agitación de la endotoxina durante30 a 60 minutos, se toma un volumen inicial de endotoxina y se comienzan a hacer las diluciones de la Curva Standard. El volumen inicial de Endotoxina a pipetear con tips apirógenos va a depender de la concentración del lote de endotoxina. (Pedir siempre el certificado de Potencia del CSE –Control Standard Endotoxin) La potencia de la endotoxina puede variar con cada lote e incluso frente adiferentes lotes de Reactivo, por lo tanto es necesario solicitar siempre el certificado de Potencia de Endotoxina frente al lote de Reactivo con el cual lo vamos a correr.

 Los viales de endotoxina no tienen una concentración declarada en la etiqueta sino solo el peso de endotoxina en cada vial 500 ng (0,5 µg). La potencia viene declarada en el certificado de Análisis que acompaña cada lote. Por...