Métodos De Dna Recombinante

métodos de DNA recombinante
Los estudios detallados de la estructura y la función de
un gen a nivel molecular requieren grandes cantidades del gen
individual en forma pura. Diversas técnicas, a menudo denominadas
tecnología del DNA recombinante, se utilizan en la
clonación de DNA, lo que permite que los investigadores preparen
gran cantidad de moléculas de DNA idénticas. El DNArecombinante es simplemente cualquier molécula de DNA
compuesta de secuencias derivadas de diferentes fuentes.
La clave para clonar un fragmento de DNA de interés es
conectarlo a una molécula vector de DNA, la cual puede replicarse
dentro de una célula huésped. Después que una única
molécula de DNA recombinante, compuesta de un vector
más un fragmento de DNA inserto, se introduce en una célulahuésped, el DNA insertado se replica junto con el vectOr
y genera un gran número de moléculas de DNA idénticas. El
esquema básico puede resumirse como sigue:
Vector+ fragmento de DNA
.j,
DNA recombinante
,j,
Replicación del DNA recombinante dentro de las
células huésped
.j,
Aislamiento, secuenciación y manipulación
del fragmento de DNA purificado
Aunque los investigadores han diseiiadonumerosas variaciones
experimentales, este diagrama de flujo indica los pasos
esenciales en la clonación del DNA. En esta sección se verán
los pasos en este esquema básico enfocándose en los dos
tipos de vectores más utilizados en las células huésped de E.
co/i: el plásmido, el que se replica junto con las células huésped,
y el bacteriófago )e, que se replica como los virus lítico,
mata lacélula huésped y empaqueta su DNA en viriones. En
las siguientes secciones describiremos la caracterización y los
diferentes usos de los fragmentos de DNA clonados.
Las enzimas de restricción y las DNA ligasas
permiten la inserción de los fragmentos de DNA
en los vectores de clonación
El principal objetivo de la clonación de DNA es obtener
regiones separadas y pequeñas del DNA de un organismoque
constituyen genes específicos. Además, sólo se pueden clonar
moléculas de DNA relativamente pequeñas en cualquiera de
los vectores. Por esta razón, las moléculas de DNA muy largas
que componen el genoma de un organismo deben cortarse
en fragmentos que puedan insertarse en el vector de DNA.
Dos tipos de enzimas, las enzimas de restricción y las DNA
ligasas, facilitan la producción demoléculas de DNA recombinante.
Corte de moléculas de DNA en fragmentos pequeños.
Las enzimas de restricción son endonucleasas producidas
por ·las bacterias que reconocen típicamente secuencias específicas
de 4 a 8 pares de bases, denominadas sitios de restricción
y luego escinden ambas hebras de DNA en este sitio.
Los sitios de restricción comúnmente son secuencias palindrómicas
cortas; esdecir, la secuencia sitio de restricción es
la misma sobre cada hebra de DNA cuando se la lee en la dirección
5' -t 3' (fig. 9-10).
Para cada enzima de restricción, la bacteria produce también
una enzima de modificación, que protege al propio DNA
bacteriano de la escisión mediante su modificación en cada
sitio posible de escisión o cerca de él. La enzima de modificación
adiciona un grupometilo a una o dos bases, casi siempre
dentro del sitio de restricción. Cuando se encuentra allí
un grupo metilo, la endonucleasa de restricción no puede cortar
el DNA. Junto con la endonucleasa de restricción_______________, la enzima
metilante forma un sistema de modificación y restricción
que protege al DNA del huésped mientras destruye al
DNA extraño entrante (p. ej., el DNA delbacteriófago o el
DNA incorporado durante la transformación) mediante la escisión
de todos los sitios de restricción en el DNA.
Muchas enzimas de restricción realizan cortes escalonados
en las dos hebras de DNA en sus sitios de restricción y
generan fragmentOs que:: tie::ne::n una "cola" de hebra simple
en ambos extremos (véase fig. 9-10). Las colas sobre los fragmentos
generados en un sitio de...