Manual de extraccion de ADN

PRACTICA NO 2 EXTRACCION DE ADN

1. INTRODUCCION
Las características de un organismo están especificadas en su información
genética, la cual está representada como una secuencia de ácidos nucleicos,
donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma.
Quizás de los procedimientos en biología molecular, el más básico es la
purificación de ácidos nucleicos, en la forma de ADNo ARN. Por lo tanto se
requieren métodos seguros para la separación de estos componentes de las
células. Para lograr esto, se utilizan diversos métodos de extracción dependiendo
del tipo de tejido a emplear, fresco, seco o congelado.

2. OBJETIVOS
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Identificar las etapas indispensables en los protocolos de extracción de
ADN
Comparar varias técnicas de extracción de ADN
Realizarun procedimiento modelo para la obtención de ADN

3. MARCO TEORICO
El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material
inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El método utilizado
para romper la célula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el
menor daño posible al ADN. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica,pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar
la degradación enzimática de la pared celular (si está presente) y lisis con
detergentes de las membranas celulares. Seguido al rompimiento celular la
mayoría de métodos involucran una desproteinización, lo cual se lleva a cabo con
un solvente orgánico, seguido de una precipitación con isopropanol o etanol yposterior solubilización con agua o tampón.
Existen diferentes técnicas para la extracción del ADN, aunque todas conservan el
uso de los mismos principios y fundamentos.

Para obtener ADN a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre periférica),
células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa
generalmente una técnica de cuatro pasos secuenciales:
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El primer paso consiste en la lisis de las células y los núcleos.
Luego, la separación del ADN a partir de sangre total involucra la lisis de
eritrocitos, seguida por una lisis de leucocitos y de sus núcleos.
Las proteínas celulares son entonces removidas por un paso de
precipitación salina, y
Finalmente el ADN genómico es concentrado por precipitación con
isopropanol.

El ADNpurificado por medio de este proceso, está listo para ser utilizado en
diferentes aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestión
con endonucleasas de restricción, Southern blot y Dot blot.
Existen otras técnicas que permiten la obtención de ADN genómico a partir de
muestras sólidas y líquidas, que permiten la separación simple, rápida, segura y
eficiente del ADN. Estaseparación se basa en la utilización del isotiocianato de
guanidina, como solución de lisis celular, lo cual permite una precipitación
selectiva del ADN con etanol y solubilización en agua o en 8 mM de NaOH. Este
procedimiento se puede realizar en 30 minutos, recobrando un 70% a un 100% del
ADN.

PRE- LABORATORIO
Diferentes métodos y tecnologías están disponibles en el mercado para realizar elaislamiento de DNA genómico. En términos generales la separación del DNA de
los componentes celulares puede ser dividida en cuatro etapas:
a.
b.
c.
d.

Disrupción o alteración de la membrana
Lisis
Remoción de proteínas y contaminantes
Recuperación del DNA

Teniendo en cuenta el enunciado anterior responda:
Los pasos a y b son combinados. Se emplea un buffer de lisis que contieneprincipalmente EDTA y SDS. ¿Cuál es la función de estos dos reactivos
dentro de este contexto?
¿Qué tipo de enzima se emplea para realizar la remoción de proteínas?

La recuperación del DNA se puede realizar mediante diferentes métodos,
los más comunes son: Salting-Out, extracción orgánica con fenolcloroformo, gradientes de densidad de cloruro de cesio, métodos basados
en sílica-gel o...